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プロテオミクスに基づく薬物標的の発見と作用機序の研究

2010年 9月 2日

何慶瑜

何慶瑜:暨南大学生命・健康工学研究院 院長

1963年3月生まれ。暨南大学生命・健康工学研究院院長。1995年、英国シェフィールド大学生物化学博士号取得。1992年、英国オックスフォード大学客員教授。1996-2002年、米国バーモント大学ポストドクター、副研究員、研究助教授。2002-2006年、香港大学助教授。暨南大学生命科学技術学院副院長および遺伝子工学薬物国家工学研究センター副主任を兼任。2006年、国家人事部、科学技術部など7つの部と委員会による「新世紀百千万人才プロジェクト」国家レベル人材。2007年、「長江学者」特別招聘教授。
近年は一貫してケミカルバイオロジーと機能プロテオミクスの領域における研究に力を注ぎ、鉄イオンの人と細菌細胞中の伝達およびヒト疾患に関するプロテオミクスの研究などの領域において研究。関係する科学研究成果は、米国国立がん研究所(NCI)および米国NewsRXの特別評価を獲得。世界の定期刊行物に100編余りのSCI論文を発表、インパクトファクターは>4、被引用回数は2000回を超える(2010年8月現在)。先発明主義により米国の特許2種目を取得、米国の書籍4部を監修。
英国Daiwa Adrian Prize (The Daiwa Anglo-Japanese Foundation, 1996)および米国心臓協会学会賞Scientist Development Grant Award (American Heart Association,2002)受賞。米国の定期刊行物2種類の常任編集委員、および世界の著名な生物化学雑誌「Molecular and Cellular Proteomics」、「Journal of Biological Chemistry」、「Proteomics」、「Journal of Proteome Research」など20種類の定期刊行物の出版顧問。
米国American Society for Biochemistry and Molecular Biology会員、英国ロイヤル化学学会Royal Society of Chemistry高級会員(FRSC)、香港プロテオミクス学会事務長、中国プロテオミクス専門委員会委員。

 プロテオミクスは何らかの条件下における細胞内の全てのタンパク質の動態変化を研究対象とする技術手段であり、高分解能タンパク質分離技術と高度なマススペクトル技術に基づき、試料中のタンパク質の種類と含有量をハイスループット、系統的に分析、鑑定することができる。薬物の研究開発には標的の確定、先導化合物の選択、低分子薬のスクリーニング、薬品の最適化、臨床試験などのプロセスがあるが、標的の確定は薬物の設計を決定づける。薬物設計における標的は、ほとんどがタンパク質であることから、プロテオミクスのいくつかの主な技術プラットフォームが、標的の発見と作用機序の研究において、おのずと重要な役割を担うこととなる。また、プロテオミクスは薬物の有効性と副作用の評価、さらには薬物設計の最適化にも用いることができる。

1.プロテオミクスの主な技術プラットフォーム

 2-DEと MALDI-TOF MS:二次元電気泳動(Two-Dimensional Electrophoresis、2-DE)は、最も早くから採用されているプロテオミクス分析技術である。細胞または組織の分裂・分解物に一次元目の等電点電気泳動を行い、タンパク質の等電点の違いに応じて複雑な試料を一次分離し、それからポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量の違いに基づき二次分離を行う。二度の分離を経た後の複雑な試料に、ゲル上でクマシーブリリアントブルー染色または銀染色を行うと、分散したタンパク質スポットが現れる。画像ソフトで分析を行い、差異のあるスポットを見つけたらスポットを切り出し、酵素分解とMALDI-TOF MS質量分析を行って差異タンパク質のペプチドマスフィンガープリントを得るとともに、データベースと照合して差異タンパク質を鑑定する。正常組織と病理組織の試料を選んで二次元電気泳動を行い、両者のタンパク質発現プロファイルの差異を分析する。この時、同じグループの2つの試料中における同種タンパク質の含有量の差異が、タンパク質スポットの差異として現れる。このため、二次元電気泳動は腫瘍標識や薬物標的の発見などの面において、幅広く採用されている。この他、タンパク質の翻訳後修飾、例えばリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化などの修飾は、タンパク質の等電点や分子量に変化をもたらし、ゲル上の位置の変化となって現れる。そのため、二次元電気泳動はタンパク質の含有量の差異を見つけられるだけでなく、タンパク質の翻訳後修飾による変化を鑑定することもできる。二次元電気泳動と併用されるMALDI-TOF MSは、最も普遍的に用いられる質量分析技術である。試料にレーザーからエネルギーを吸収できるマトリックスを混合し、マトリックスがレーザーにより励起されると、光エネルギーを試料へ伝達して試料を帯電させ、イオン化した試料が高真空中で飛行し、その飛行時間を精確に記録して計算する。各種ペプチドがマススペクトル上に質量電荷比M/Zの小さいものから大きいものへと表示される。MALDI-TOF MSではペプチドの分子量、アミノ酸の配列、および修飾の状態などの情報が得られ、コンピューターで複数のペプチドの情報を総合して計算し、タンパク質の最終鑑定を行うことができる。

 SELDI-TOF MS:SELDIチップシステムは、プロテインチップ技術に基づきタンパク質の分離とスクリーニングを行うプラットフォームである。特別に化学修飾または生物化学修飾されたプロテインチップを持ち、タンパク質の疎水性や帯電性などの違いに応じて、複雑なタンパク質試料を効果的に分離し、いずれかの成分と特異的に結合して質量分析を行い、タンパク質の分子量情報を取得する。SELDIシステムの長所は、非常に少ない試料で分析を行うことができ、かつ分子量が6kDaに満たない低分子タンパク質とペプチドまで検出できるため(He et al., 2003)、血清中の含有量が低い低分子量の成分でも、高い分解能が得られるところにある。SELDI-TOF MS分析に用いる試料は、組織や細胞の直接の分裂・分解液や血清であり、酵素分解を経ておらず、一次マススペクトルのデータしかないため、タンパク質の分子量の情報しか得ることができない。

 LC-MS/MS:二次元電気泳動とプロテインチップ技術では、これらのみでは、研究者の高感度で系統的な分析に対するニーズを満たすことができないが、高速液体クロマトグラフィーHPLCとエレクトロスプレーイオン化分析法ESI-MS/MSを合わせて使用することで、試料中のタンパク質の分離とタンパク質の鑑定を系統的に結びつけ、プロテオミクス分析の分解能と感度を効果的に向上させた。LC-MS/MSはゲル分離技術から離れ、高度なオートメーション化を容易に実現し、作業が煩雑なために再現性が劣るという問題を効果的に低減させた。タンパク質ペプチド標識技術と結びつけ、LC-MS/MSは定量プロテオミクスの研究において、広範かつ高度に応用されている。ラジカルまたは同位元素を利用して、複雑な試料中のタンパク質に標識を行う。標識後のタンパク質またはペプチドは、質量電荷比M/Zに変化が生じ、質量分析により識別され、コンピューターによるデータ処理で定量情報を得ることができる。

figure 1

Figure 1. The various platforms of the proteomic analysis

2.定量プロテオミクス:

 プロテオミクス分析は通常の場合、2種類の状態の細胞、組織または体液を対象とし、そのうちの1種類の試料に対して化学標識または生物標識を行う。酵素分解後に発生するペプチドの質量電荷比に差異が生じるため、ソフトウェアによる計算で、同種タンパク質の異なる試料中の相対定量情報を求めることができる。現在、タンパク質またはペプチドの標識方法には、細胞培養におけるアミノ酸を用いた安定同位体標識法(stable isotope labelling with amino acid in cell culture、SILAC)(Ong et al., 2002)、相対および絶対定量用同重体標識法(isobaric tags for relative and absolute quantitation、iTRAQ) (Shadforth et al., 2005)、コードアフィニティータグ法(Isotope-coded affinity tag、 ICAT) (Gygi et al., 1999)などがある。

 SILAC:これは細胞体内のタンパク質を同位体で標識する技術方法で、細胞を培養する際に、その中の1種類の細胞培地中のリジンとアルギニンを、重い炭素と窒素の同位体で標識し、これを重鎖培地とする。もう1種類の培地中のリジンとアルギニンは重い同位体で標識せず、これを軽鎖培地とする。この2種類の培地を用いて細胞をそれぞれ継代培養すると、細胞は培地中のアミノ酸を利用してタンパク質を合成し、これによって細胞内のタンパク質も、重い同位体によって相応に標識され、酵素分解後に発生するペプチドの質量電荷比の差異が、タンデム質量分析MS/MSにより識別、計算される。この技術の最大の長所は、細胞の生理学的状態に影響しないことを前提条件として、細胞の生体標識が行えるところにある。

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Figure 2. Common work flow of SILAC

 iTRAQ:近年、米国のアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems Incorporation、ABI)が開発したiTRAQの技術は、4種類の試料の絶対定量と相対定量を同時に行うことのできる方法である。iTRAQ試薬は、N末端アミノ基およびリジン側鎖とつながることのできる、異なる同位体標識のレポーターグループとバランスグループから構成される。異なる試薬はタンデム質量分析の中で、レポーターグループのイオンシグナルを異なる質量電荷比(114~117)のピークとして表示する。そこでピークの高さおよび面積に基づき、タンパク質の定量情報を得ることができる。

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Figure 3. ITRAQ labeling strategy

  ICAT :コードアフィニティータグ法では、タンパク質と反応するラジカル、エチレングリコール結合区およびビオチン標識を含んだ試薬を使用する。商品化されたICAT試薬はタンパク質またはペプチド中のシステインのスルフヒドリル基とだけ反応し、同位体標識試薬には 8原子の水素を持つ軽い試薬と8原子の重水素を持つ重い試薬がある。分析を行う際は、通常は異なる試料を軽い試薬と重い試薬でそれぞれ反応させ、酵素分解の後にタンデム質量分析を行い、同様に一定の相違の質量電荷比のピーク間の強さの違いに基づき、タンパク質の定量情報を求める。

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Figure 4. ICAT quantitative proteomics

3. 薬物標的と作用機序の研究におけるプロテオミクスの採用

 現在、プロテオミクスは主に薬物作用の標的の発見と作用機序の解明に採用されている。一方ではケミカルプロテオミクスを用いて薬物標的を直接発見し、他方では定量プロテオミクスによって薬物作用のシグナル伝達経路を探求する。

3.1 アフィニティークロマトグラフィーに基づくプロテオミクス(chemical proteomics) 

 薬物作用の標的タンパク質の発見は、我々が薬物の作用機序を理解し、薬物を開発するための主要なボトルネックである。なぜなら我々は、ほとんどの薬物(既に臨床使用されている薬物を含む)の標的タンパク質を明確にできていないからである。ケミカルプロテオミクスの研究ポリシーは、低分子と相互作用するタンパク質を分離、純化および鑑定することを目標としており、薬物と直接相互作用する標的タンパク質を発見するのに有利である。このことから、ケミカルプロテオミクスも薬物標的指向型のプロテオミクス(target-oriented proteomics)と言うことができる。ここで、最もよく用いられるケミカルプロテオミクスの研究方法であるアフィニティークロマトグラフィー(affinity chromatography)の薬物標的の発見における作用を例に挙げて紹介する。

 アフィニティークロマトグラフィーは、通常リンカー(linker)を介して薬物分子をマトリックス(matorix)に固定し、薬物の受容体タンパク質分子の分離に使用する。理論上では、全ての薬物分子が化学修飾により固定化される可能性がある。その前提条件として、薬物分子の修飾が生物の活性を変化させないことが重要である。そこで、原則としてまず、修飾分子の生物活性の検査をしなければならない。薬物分子とマトリックスとの間には、通常立体障害が存在するが、この障害はリンカーを挿入することで解消することができる。リンカーとしてはビオチン(biotin)とポリエチレングリコール(polyethylene glycol)が、既に薬物標的の発見に用いられ成功を収めている。アガロースビーズは最もよく用いられるマトリックスで、物理学的安定性と化学的安定性に非常に優れている。

 1890年代にはいくつかの著名な研究により、薬物標的の発見における薬物分子のアフィニティーマトリックスへの固定化の応用が明らかにされた。例としてはFK506-FKBP12(FK506 binding protein 12KD)やTrapoxin-histonedeacetylase(Harding et al., 1989; Crews et al., 1996; Taunton et al., 1996)が挙げられる。FK506 (Tacrolimus、タクロリムス、プログラフ)はマクロライド系抗生物質の1種で、放線菌Streptomyces tsukubaensisの代謝産物である。FK506は免疫抑制剤としてFKBP12と結合するが、後者はタンパク質のフォールディングを助けるものである。FK506- FKBP12の間には高い親和力があり、また後者は細胞内での発現率が高いため、現在FK506- FKBP12は一般的に、アフィニティー技術の優劣を評価する実験モデルとされている。現在、我々は多くの薬物受容体タンパク質の認識について、そのほとんどをアフィニティークロマトグラフィーの功績とする必要がある。表1に薬物標的の発見におけるアフィニティークロマトグラフィーの応用成功例の一部を列挙した。このうちEpigallocatechin gallate(EGCG)は、中国の緑茶から抽出されたカテコールの1種で、抗酸化活性が非常に強く、抗がんや心臓血管系疾患の面で重要な役割を担ってきた。またこれは腫瘍の多剤耐性の逆転剤にも用いられ、がん細胞の化学治療への感度を改善するとともに、心臓毒性を軽減することもできる。Ermakova et al. (2005)は、EGCG-アガロースビーズマトリックスを合成したもので、細胞分裂・分解液中の受容体タンパク質を捉えるために用いる。2-DEで分離し、MALDI-MSで鑑定して発見されたvimentinは、EGCGの受容体タンパク質である。EGCGは高い親和力でvimentinと結合し、かつvimentinのセリン50とセリン55のリン酸化を特異的に抑制する。EGCGは細胞の増殖を抑制し、vimentinの発現をノックアウトしてこれらの抑制能力を喪失させ、vimentinとの結合、媒介によるEGCGの化学予防作用をはっきりと表す。

表1. アフィニティークロマトグラフィーにより発見された薬物標的(Cheng et al., 2010)
Natural product Origin Protein target (s) Identified
Ampicillin Microbial Penicillin-binding proteins (von Rechenberg et al., 2005 )
EGCG Plant Vimentin (Ermakova et al., 2005)
Flavopiridol Syntheticmimic Cytosolic aldehyde dehydrogenase 1 (Schnier.,1999)
Hymenialdisine Marine Glycogen synthase kinase 3, Mitogen-actived protein kinase-1, p90 ribosomal S6 kinase, b-tublin (Wan et al., 2004)
Jacalin Plant Anopheles gambiae aminopeptidase N (Dinglasan et al., 2007)
Myriocin Microbial Palmitoyltransferase subunits LCB1 and LCB2 (Chen et al., 1999)
Resveratrol Plant Dihydronicotinamide riboside,quinone reductase 2 (Wang et al., 2004), Glutathione sulfotransferase-π,Estrogen receptor-b (Hsieh et al., 2008)
Saframycin Microbial Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Xing et al., 2004)
Ent-15- oxkaurenoic acid Plant FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein, Phosphate carrier precursor isoform 1a, p53-associated Parkin-like cytoplasmic protein, Ran-binding protein 2 (Rundle., 2006)
Eponemycin Microbial Proteasomal beta-catalytic subunit LMP2 and LMP7 (Meng et al., 1999)
FR177391 Microbial Protein phosphatase 2A (Yamaoka et al., 2005)
(-)-FR182877 Microbial Carboxylesterase-1 (Adam., 2003)
2’-hydroxyl-cinnamaldehyde Plant Proteasome subunit alpha type 1, Proteasome subunit alpha type 4 precursor (Hong et al., 2007)
Pateamine A Marine Eukaryotic translation initiation factor 4 (Bordeleau., 2005)

 アフィニティークロマトグラフィーは、薬物標的の研究に今なお常用される方法である。しかしその制約性も日増しに顕著になっており、例えばリガンドと受容体の間に高い親和力がなければ何回もの洗浄に耐えらない、試料のタンパク質の量が多くなければならない、低含有量のタンパク質を検出するのが難しいなどの制約がある。東京工業大学の半田宏教授は、高い親和力をそなえるラテックスビーズ(latex bead)を合成することにより、アフィニティークロマトグラフィーそのものを改善した(Shimizu et al., 2000; Sakamoto et al., 2009)。こうした新型のSGビーズは、メタクリル酸グリシジル(glycidylmethacrylate)とスチレン共重合体を芯に持ち、表面はメタクリル酸グリシジルでコーティングされている。FK506-FKBP12モデルで評価実験すると、SGビーズは標的タンパク質の純化を向上するとともに、タンパク質の非特異的な結合を減少させた。半田教授は自ら合成したSGビーズを用いて、サリドマイド(Thalidomide)の直接標的のタンパク質を捉えることに成功した(Ito et al., 2010)。サリドマイドは1950~60年代初頭にかけ、鎮静剤として世界中で幅広く使用された。妊婦のつわりを効果的に抑えることができたが、人々を驚愕させたのは、その副作用で多くの「アザラシ肢症児」の誕生を引き起こしたことである。サリドマイドの作用する受容体標的タンパク質がわからなかったため、これまでずっと畸形を引き起こした分子機序を解明できずにいた。半田教授はサリドマイド-SGビーズ固定アフィニティークロマトグラフィーにより、サリドマイドと直接結合するタンパク質分子がcereblon (CRBN)であると鑑定した。半田教授らはゼブラフィッシュやニワトリを用いて動物実験を行い、CRBN、損傷DNA結合タンパク質1(DDB1)およびCul4で形成されるユビキチンリガーゼ複合体が、動物の四肢の発育にとって重要であり、サリドマイドはCRBNと結合してユビキチンリガーゼの活性を阻害し、畸形を形成することを突き止めた。半田教授の研究は、催奇形性のない新型サリドマイド誘導体の開発にとって、極めて重要なものである。また、より高感度な定量プロテオミクス技術を取り入れ、低含有量タンパク質の標的の発見を向上させることもできる。

3.2 差次的発現プロテオミクス(differential expression proteomics)

 薬物処理と対照試料のタンパク質発現レベルの差異を比べると、媒介薬物の治療効果と副作用の分子機序を解明できる可能性がある。この数年、我々は2-DEを用い、腫瘍の発生と抗がん剤の作用機序に関する一連の研究を行ってきた。腫瘍発生メカニズムの研究においては、我々は世界で初めてプロテオミクスを用いて舌がんと口腔がんの研究を行い、腫瘍の発生が複数の細胞経路と関係していることを発見した。これは複数の標的分子に同時に介入しなければ、この疾病の効果的な治療方法とならないことを意味している(Chen et al., 2004; He et al., 2004)。

 ジオスシン(dioscin)はステロイドサポニンに属し、自然界ではヤマノイモ科植物のウチワドコロ(Dioscorea nipponica Makino)、盾葉薯蕷(D. zingiberensis C.H. Wright)、福州薯蕷(D. futschauensis Uline)の根や茎などの植物中に存在する。伝統的な漢方薬(dioscinなど)に高いがん予防と化学治療価値があることは普遍的に知られているが、その分子作用機序についてはよくわかっていない。我々は2-DEを利用して、dioscinの白血病細胞HL-60に対する抗がん活性について研究を行った。dioscinで処理したHL-60細胞および未処理のHL-60細胞の総タンパク質をそれぞれ2-DEで分離し、差次的に発現したタンパク質をMALDI-MSを用いて鑑定した。その結果、我々はミトコンドリアATP合成酵素、fumarase、haperoninsといった一部のミトコンドリアタンパク質が差次的に発現するのを観察した。そこで、我々はdioscinのHL-60細胞アポトーシス誘導の標的はミトコンドリアであるとの仮説を立てた(Wang et al., 2006)。もう1つの研究として、さらにこの仮説の実証を行った。dioscinで処理すると、ミトコンドリアの膜電位に変化が生じ、caspase-3とcaspase9が活性化するが、これはミトコンドリアが細胞のアポトーシスを媒介したことの典型的な表れである。2-DEではdiloscinがHL-60細胞をアポトーシスさせる誘導経路を解明することに成功したものの、細胞の総タンパク質の複雑さは、2-DEさらにはLC-MS/MSの分解能を著しく超えるものである。試料の複雑度を下げる有効かつ簡単な方法は、亜細胞のプロテオームの分離を行うことである。diloscinのアポトーシス誘導の機序をさらに深く研究するために、我々はまずミクロゾームの可溶性タンパク質を分離し、それから2-DE分離を行った。37個のタンパク質が差次的に発現したことは、diloscinで処理した細胞が活性酸素・フリーラジカルの発生を導くことができることを表わしている。機能研究を行った結果、さらに増加した活性酸素・フリーラジカルの主要発生源がミトコンドリアであることが実証された(Wang et al., 2007)。以上の研究を総合すると、diloscinはまずミトコンドリアに作用し、ミトコンドリアから発生した活性酸素・フリーラジカルがさらに細胞アポトーシスのシグナル経路を媒介することになる。我々の研究ではdioscinの受容体タンパク質分子は解明されていないが、その作用の主な分子機序が明らかになった。

 俗に亜ヒ素と呼ばれる三酸化ヒ素(As2O3)は、最も古い歴史を持つ毒物の1つである。しかし近年の研究により、三酸化ヒ素は急性前骨髄球性白血病(acute promyelocytic leukemia、APL)に対して著しい臨床効果をそなえ、さらに胃がん、肺がん、前立腺がん、肝がんなどの実体腫瘍の生長を抑えることもできる、広域スペクトル抗腫瘍薬であることがわかった。プロテオミクスの研究方法を利用して、我々はヒ素とがんの関係の濃度依存性メカニズムを解明した。低濃度のヒ素は細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)を刺激することで細胞の増殖を促進し(He et al., 2003)、高濃度のヒ素はc-Jun-N末端キナーゼ(JNK)を刺激して酸化ストレスを発生させることで、細胞アポトーシスを誘導する(Lau et al., 2004.)。多発性骨髄腫の研究においては、我々はさらにヒ素が14-3-3zetaとHSP90を介して細胞アポトーシスを誘導することを発見した(Ge et al., 2009)。これらの発見は、砒素になぜ発がんと抗がんの二重作用がそなわるかの更なる研究に役立つものであり、また14-3-3zetaとHSP90が多発性骨髄腫の治療のための薬物標的となる可能性についてヒントを与えるものとなった。

 gold(III) porphyrin 1a化合物は、既存の抗腫瘍薬と比べ、細胞毒性が高く副作用が低いという特徴があることから、大いに注目されている。我々は研究により、gold(III) porphyrin 1aがミトコンドリアを介してcaspase依存型および非依存型細胞のアポトーシスを誘導できることを発見し、gold(III) porphyrin 1aを、ミトコンドリアを標的にした抗がん剤とすることができると明らかにした(Wang et al., 2005; Wang et al., 2006)。我々はさらにプロテオミクスの方法により、gold(III) porphyrin 1aの細胞中における薬物学的特性をいっそう明らかにした(Wang et al., 2007)。

 この他にも、我々はtamoxifen (Wang et al., 2007)、chromium (Lei et al., 2008) 銀ナノ粒子(Lok et al., 2006)およびその他の抗がん作用のある中薬、例えばTubeimoside-1 (Xu et al., 2009)やindioside D (Wong et al., 2008)などの毒性およびその作用メカニズムについて研究を行っている。これらの作用のシグナル伝達経路および標的タンパク質分子が発見され、新薬の開発にいっそうの基礎を固めることができればと考えている。

3.3 リン酸化プロテオミクス(phosphoproteomics)

 タンパク質翻訳後(リン酸化など)にシグナル伝達経路において重要な作用を果たすことから、リン酸化タンパク質は、世界における標的抗がん剤スクリーニングの重要な資源となっている。現在では新型抗がん剤の80%以上がシグナル経路のプロテインキナーゼを標的としているが、その一方でプロテインキナーゼの活性化には、往々にして一定の化学修飾を必要とする(リン酸化など)。大多数のリン酸化タンパク質は体内における含有量が低く、質量分析で直接検出するのは困難であるため、リン酸化タンパク質またはリン酸ペプチドの富化を行わなければならない。リン酸化タンパク質を富化する最も簡単な方法は、リン酸化アミノ酸残基を識別する特異的抗体を用いて共免疫沈降を行い、複雑な混合物からターゲットとするタンパク質を免疫沈降することである。現在、効果的な共免疫沈降を行うことができるのは、チロシンリン酸化タンパク質のモノクローナル抗体しかない。この抗体には高い親和力と特異性がそなわるため、チロシンリン酸化タンパク質を効果的に免疫沈降できるのである。リン酸ペプチドの富化に常用される方法には、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography、 IMAC)、強陽イオン交換(strong cation exchange、 SCE)、TiO2クロマトグラフィーなどがあり、それぞれに長所と短所を持つ。固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーは、リン酸基と固定化したFe3+、Ga2+、Cu2+などの金属イオンの高い親和力を利用してリン酸ペプチドを富化するもので、リン酸ペプチドの分離富化技術としては比較的成熟している。TiO2クロマトグラフィーは、リン酸化ペプチドを富化する際のスクリーニングと感度においてはIMACより優れているものの、なお非特異的吸着などの問題を残している。強陽イオン交換技術は、+1の有効電荷を帯びるリン酸化ペプチドをスクリーニングして富化するため、+2以上の電荷を帯びるリン酸化ペプチドが失われやすくなる。大規模なリン酸化分析実験においては、常に複数のリン酸化ペプチドの富化方法が総合的に使用されている。

 我々は既にリン酸化プロテオミクスのための万全なプラットフォームを確立するとともに、薬物機序解析のためのリン酸化プロテオミクスの研究を成功裏に展開している。Genisteinは天然のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤で、G2/M期にブロックとアポトーシス誘導を促す抗がん作用をそなえるが、その媒介となるリン酸化チロシンのシグナル伝達経路ははっきりしていない。胃がん細胞のgenistein処理を行う前と後の細胞内のリン酸化タンパク質の差異を比較することにより、我々はgenisteinが主に典型的な受容体-MARKまたは受容体-PI3K/AKTのシグナル伝達経路を抑制することを発見した(Yan et al., 2010)。

4. 結論と展望

 20年近くの発展を経て、プロテオミクスは既にハイスルーブットなスペクトル分析の成熟した技術手段とプラットフォームとなっており、特に薬物標的の発見においては、重要な役割を担っている。ケミカルプロテオミクスでは、アフィニティークロマトグラフィーの技術を駆使し、薬物と相互作用するタンパク質を発見する;薬物が作用する前後のタンパク質の発現の差異を全面的に分析することは、薬物標的を発見するための主要手段である。アフィニティークロマトグラフィーの非特異的吸着と受容体タンパク質の含有量が低いという主要な課題がなお残ってはいるが、2つの方法を系統的に結びつけることで、より多くの薬物標的の情報を提供することができ、ケミカルプロテオミクスを用いて薬物受容体を効果的に探すことができる。差次的発現プロテオミクスでは、薬物作用が関わるシグナル経路の情報を分析することができ、ケミカルプロテオミクスの構造情報および薬物相互作用タンパク質の情報と結びつけることで、薬物作用の基本的な分子機序を確立することができる。またマススペクトル技術が急速に発展したことで、分子量が100kDaを超える薬物タンパク質複合体の分析も可能となった。このことから、我々はプロテオミクスが今後の薬物-タンパク質の相互作用の研究の助けとなり、薬物の合理的な設計のために重要な構造情報を提供するとともに、より多くの薬物作用に内在する分子機序を解明できると信じている。

主要参考文献:

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