第52号：植物科学
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植物由来有用二次代謝産物の産生に関する分子育種研究

2011年 1月 7日

佐藤文彦

佐藤文彦（さとう　ふみひこ）：
京都大学大学院生命科学研究科教授

1953年2月生まれ。
1979年　京都大学大学院農学研究科博士後期課程中退
1981年　京都大学農学博士
1990年 11月 京都大学農学部助教授
1995年 6月　京都大学農学部教授
1997年 4月 京都大学大学院農学研究科教授
1999年 4月　京都大学大学院生命科学研究科教授（現在に至る）

受賞

1999年 10月 日本植物化学調節学会賞受賞
2007年 4月　科学技術分野の文部科学大臣表彰科学技術賞受賞
2007年 7月　植物細胞分子生物学会学術賞受賞

　植物は，食料・エネルギー源として我々の生存の源であるとともに，環境浄化・環境保全のための資源としても重要である。従って、植物の様々な機能を改良するための研究が世界中で行われている。特に、植物は分化全能性をもち、細胞から個体が容易に再生できることから、遺伝子組換え技術により機能改変された様々な作物も作成され、利用されている。ここでは，植物細胞全能性機能の一側面である有用二次代謝産物産生に関して、我が国の研究動向を中心に紹介したい。

　植物を特徴づける代謝機能として二次代謝機能があり、植物が産生する多様な低分子化合物は香辛料や染料、香料、医薬品等として、また、カロチノイド（プロビタミンA）のように微量栄養素や機能性食品等としても利用されている。こうした二次代謝研究は我が国では伝統的に農芸化学，あるいは生薬化学分野において研究され、実利用されてきた。これらの化合物を生産する植物は、既に、作物として品種が確立され栽培されているものもあるが、依然、自然からの採取に依存したものも多い。特に，漢方薬原料は、栽培の困難さと栽培期間の長さから、天然からの採取、特に、中国からの輸入に頼っているものが多い（1）。例えば、様々な処方に含まれる甘草は年間消費量1600トンのほとんどを中国からの輸入に依存している。一方、重要な薬用植物を国内生産することは、古来試みられてきたが、生産性の低さ、ならびに国内製品の価格の高さから、現実は、輸入に、より依存する傾向がある。

　しかし、中国からのレアアース輸出制限がハイテク産業に与えた影響が示すように、過度の海外依存にはリスクが伴う。さらに、薬用植物に関しては、季節や環境変動等の生産の変動リスクがあり、より持続的な薬用植物の人工的生産が試みられてきている。特に、最初に述べた植物の全能性機能にもとづいた有用物質生産は、耕地面積の限られている我が国において、望ましい生産方法として多くの先人が試みてきたものであり、1980年代初頭には、ムラサキの培養細胞から生産されたナフトキノン（シコニン）を用いた化粧品（バイオ口紅）が販売されるに至っている（2）。しかし、細胞培養法を用いた有用物質生産系の開発は、一部の化合物を除いて低迷しているのが現状である。例えば、イチイの樹皮から抽出されるパクリタクセル（商品名タキソール）は自然保護のため、代替の製法が要求され、大量に調製が可能なイチイ葉に含まれる前駆体（バッカチンIII）からの化学変換、あるいは、細胞培養法による生産が利用されているが、それ以外の化合物は競合する天然からの生産に打ち勝てないでいる（3）。現在、細胞培養法の利用は，オタネニンジン培養細胞を用いたニンジンエキスや、ミシマサイコ培養根によるサイコサポニンの生産等のわずかなものに限られている（4,5）。

　細胞培養法による有用物質生産の最大の課題は、天然からの収穫品に対する経済性の低さと、現在利用されている薬用植物代替品としての品質保証データの不十分さに起因する。そのため、パクリタクセルのように極めて付加価値の高い成分を生産する場合等に利用が限定されている。なお、ごく最近、特定の細胞組織を用いることにより高効率で有用物質生産培養細胞系を確立することが可能であるとの論文が報告（6）されたが、多くの二次代謝産物の生産には複数の細胞組織の関与が必要な場合があり、従来から試みられている根などの器官培養系の利用がより現実的と思われる（7）。

　一方、薬用植物個体を、植物工場を用いて栽培する試みも近年活発に研究され、一部実用段階に近いと思われる成果がプレスリリースされている（8）。甘草の場合、収穫に４年程度かかる栽培期間を１年から１年半に短縮できたという報告がなされているが、依然、１年を越える栽培期間が必要であり、甘草のようにkgあたり10ドルを下回る比較的低価格商品に生産コストが見合うのかという課題がある。

　そうした中、我々が注目しているのが、特定の化合物を植物の細胞培養、もしくは、微生物を用いた発酵により生産するという方法である。漢方薬原料を生産するという視点からすると課題はあるが、漢方薬の主成分の生産系としては有効と考えられる。特定の成分を大量に生産する方法としては、これまでにも、植物体、あるいは、培養細胞を変異させ、有効成分の含量を増加する、あるいは、組成を変換する試みがあったが、近年の分子生物学の進展は、遺伝子レベルで二次代謝機能を改変することを可能としている。特に、日本では、細胞培養法を用いて、有用二次代謝産物を高生産する培養細胞系が多数確立されており、これらの細胞株を用いた生合成酵素遺伝子の単離、ならびに、代謝工学、さらには、合成生物学が試みられている。以下、多くの有用医薬品を含むイソキノリンアルカロイド生合成系を例に、具体的に紹介する。

1. イソキノリンアルカロイド生合成酵素遺伝子の単離と機能同定

　我々のグループが1984年に確立したベルベリン高生産性オウレン培養細胞系(9)を用いたベルベリンの生産は、ベルベリン単品を生産するには価格的に見合わず、また、細胞培養エキスを局方医薬品として利用するには多くの検証が必要であり、これらの経済性から、その実用化は見送られた。しかし、我々は、この細胞系が生合成遺伝子の単離解析に適し、将来の分子育種の素材となるとの信念のもと、生合成系遺伝子の網羅的単離に着手した。1990年代初頭、イソキノリンアルカロイド生合成系で単離された遺伝子は、レチクリンを環化してスコウレリンを生成するベルベリンブリッジ酵素（BBE；10）のみであった。我々は、前述の高生産性オウレン細胞を用いることにより、世界に先駆けてベルベリン生合成酵素であるスコウレリン-9-O-メチル化酵素（SMT；11）、ノルコクラウリン6-O-メチル酵素(6OMT；12)、3’-ヒドロキシN-メチルコクラウリン4'-O-メチル化酵素(4'OMT；12)、コクラウリンN-メチル化酵素(CNMT；13)の精製と遺伝子の単離・同定に成功した。

　また、同細胞から調製したcDNAライブラリーが同生合成遺伝子の網羅的単離・解析に適しているとの予測に基づき、パルマチン合成に関与するコロンバミンO-メチル化酵素 (CoOMT)の単離にも成功した（14）。植物には、チトクロムP450（以下、P450と略す）によって触媒される反応が多数存在するが、特に、ベルベリン高生産性オウレン培養細胞を用いることにより効率的に、N-メチルコクラウリンの3’位に水酸基を導入する3’-水酸化酵素(CYP80B1)ならびに、テトラヒドロコロンバミンからテトラヒドロベルベリンへの変換を担うメチレンジオキシ環形成酵素(CYP719A1)の単離（15）、さらには、分子内C-Cフェノールカップリング反応によりレチクリンからマグノフロリンを合成するコリツベリン合成酵素（CYP80G2）遺伝子の単離・同定にも成功した（16）。

　以上のように、イソキノリンアルカロイド生合成系は、現在、フェニルプロパノイド生合成系についで、もっとも分子レベルでの解析が進んでいる二次代謝経路となっており（図１）、これら生合成酵素遺伝子の発現を調節する転写因子についても情報が集積しつつある（17）。以上のように、分子レベルでの生合成系の解明が進むにつれ、以下に述べるように、代謝工学的手法によるアルカロイド生産性の改善が現実的になってきている（18）。

図１

イソキノリンアルカロイド生合成系

太字の文字は生合成遺伝子が単離されていることを示す。

図２

合成生物学的手法によるイソキノリンアルカロイド生合成系の再構築

MAO:微生物由来モノアミン酸化酵素、他は植物由来生合成酵素

2.イソキノリンアルカロイド生合成系における代謝工学

既に述べたように、代謝工学の目的は、目的とする化合物の絶対量の増大、あるいは、混在する類縁化合物に対する相対量の増大により、目的化合物を効率的に生産することにある。絶対量の増大には、生合成の律速段階の打破と、転写調節因子を用いた包括的な生合成酵素の発現誘導がある。前者に関しては、我々の研究を含め、いくつかのグループにより、複数の生合成酵素の過剰発現が有効であることが報告されている。生合成系の律速段階の特定は難しく、酵素遺伝子の過剰発現の効果は個々の植物種により異なるが、ハナビシソウ(6OMT；19)、オウレン(4’OMT;20)、ケシ（CYP80B3;21）等において、律速酵素の過剰発現がアルカロイド含量の増大に有効であることが報告されている。一方、転写因子の調節による生合成酵素の包括的誘導はより魅力的なアプローチであり、内在の転写因子の単離が試みられる(17)とともに、アルカロイドを生産しないモデル植物であるシロイヌナズナの転写因子を用いた研究もなされている(22)。

　一方、有効成分組成の改善において重要なことは、目的産物以外への化合物の蓄積をもたらす不要な生合成経路の遮断である。突然変異ならびにトランスポゾンなどの挿入による遺伝子破壊は一遺伝子だけの抑制となるために、複数のファミリー遺伝子が機能している場合には、経路の遮断が不十分となる。従って、別の抑制システムの開発が必要であるが、これまでに開発されたアンチセンス法では抑制効率が低くかった。こうした中、二本鎖RNAによる遺伝子抑制（いわゆるRNAi）が報告され、その効果が実証されるに至っている。RNAi法は抑制効率が高い一方、20残基程度の相同領域が存在すると遺伝子発現抑制が生じうることから目的の標的外遺伝子への影響もあり得るなどの課題はある（23）が、特定の酵素段階においては、非常に効果的に発現を抑制し、９０％以上の純度で目的の代謝中間物の蓄積が可能となる可能性が示されている（24）。

　以上の代謝改変は特定の化合物の生産を促進する試みであるが、新規な化合物を生産させようとする試みもある。ハナビシソウはイソキノリンアルカロイドの一種ベンゾフェナンスリジン型のアルカロイド（サングイナリン等）を蓄積する一方、ベルベリンは生合成しないことから、ハナビシソウに新たな分岐経路、すなわち、ベルベリン生合成系のスコウレリン-9-O-メチル化酵素（SMT）を導入することによりベルベリン型アルカロイドを合成する細胞系の構築を試みた。その結果は我々の予想を裏切るものであり、ベルベリン型のアルカロイドとともに、従来からあるベンゾフェナンスリジン型のアルカロイドの蓄積が認められた。但し、検出されたベンゾフェナンスリジンアルカロイドは、野生株では通常検出されないものであり、内在する生合成酵素群がSMT反応により新たに合成された化合物を代謝したと考えられた（25,26）。このことは、植物の二次代謝系の可塑性を示しており、代謝工学により、より多様な化合物の生産の可能性が示されるとともに、先に示したRNAi法を併用することにより、より多様な目的産物を蓄積生産できるものである。また、近年、生合成酵素の改変もなされており（27,28）、これらの酵素を代謝工学に組み合わせる、あるいは、人工的基質を投与する等により、植物細胞における、より多様な産物の合成が期待できる。

3. イソキノリンアルカロイド生合成系の合成生物学

　植物の生産する様々な有用産物をより簡便に生産する方法として、植物の生合成系をより生育の早い微生物等に導入しようとする試みがある。こうした試みは、微生物の生産する多価不飽和脂肪酸やビタミン類で行われてきたことであるが、近年、植物特有の代謝産物の生合成遺伝子の単離が進み、植物特有の代謝産物生合成系の再構築が試みられている。例えば、微生物のもつイソプレノイド生合成系を基盤として、テルペノイドであるアルテミシニンやパクリタキセルの生合成系の再構築が試みられている（29, 30）。同様に、レスベラトロールのようなフェニルプロパノイド生合成系の再構築も試みられているが、近年、より植物に特有といえるアルカロイドの生合成系が再構築されるに至っている（31, 32）。微生物による二次代謝生合成系の再構築の最大の利点は、任意の生合成酵素の組み合わせにより、代謝産物を自在に制御できること、ならびに基質を容易に添加できることである。我々の場合で、現状、5mMのドーパミンの投与により55mg/L/h程度のレチクリンの合成が達成されている。この生産性は、高ベルベリン生産性培養細胞におけるベルベリン産生（最高1.4 g/L/21日）、RNAiにより特異的にレチクリンを培地に蓄積する形質転換ハナビシソウ細胞を用いたレチクリン産生（0.3 g/L/21日）を遥かに上回る結果である。また、生合成系の再構築による合成は、化学合成では通常困難な天然型(S)体に特異的な光学異性体の合成が可能となるとともに、さらに多様な酵素遺伝子を組み合わせた新たなアルカロイド生産の可能性を示している。

おわりに

　今回、我々のイソキノリンアルカロイド生合成研究を中心に、我が国における植物二次代謝研究、特に、薬用植物関連の物質生産に関しての動向を取りまとめた。最初にも述べたように、我が国では伝統的に薬用植物細胞培養系を用いた有用物質生産研究が行われており、多くの代謝物高生産性細胞系が確立されている。これらの培養系を用いた代謝研究は、漢方薬としてのみならず、多くの食品添加物に用いられる甘草のグリチルリチン（33）や重要な制がん剤であるカンプトテシン (34)、あるいは、抗酸化作用が注目されているゴマのセサミン生合成の代謝工学(35)など、活発に展開されている。また、我が国の研究の特徴は、先に挙げた代謝工学、合成生物学にとどまらず、代謝系そのものをメタボロミックス／トランスクリプトミックス等を用い、統合的に解析する(36)ところにある。今後、これらの成果がさらに活用されることにより、植物由来有用二次代謝産物の生産系の改良、薬用植物の生産開発が進展するものと期待される。

主要参考文献：

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