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家畜クローニング技術の中国における研究の進展と現状

2011年 2月25日

曽申明

曽申明(Zeng Shenming):
中国農業大学動物科学技術学院 胚胎生物技術実験室 教授

1968年11月生まれ。1996年中国農業大学で農学博士号を取得するとともに、同大学にて教学と科学研究業務に従事。現在、動物科学技術学院教授、博士課程指導教官を務める。中国畜牧獣医学会動物繁殖分会常務理事。「Biology of Reproduction」、「Theriogenology」、「Reproduction in Domestic Animals」、「Reproduction Fertility and Development」、「Animal Reproduction Science」、「中国科学」、「中国農業科学」、「生物物理学報」、「中国畜牧雑誌」、「中国畜牧獣医」、「畜牧獣医学報」、「生物工程学報」、「農業生物技術学報」等の原稿審査専門家。
この5年間に、国家レベル科学研究テーマ計11件を主宰し、科学研究成果3件がそれぞれ北京市科技進歩2等賞、中国大学科学技術1・2等賞を受賞。国内外において中核的学術定期刊行物に研究論文60篇余りを発表、うちSCIに12篇が収録される。専門著書3冊―『シカの養殖 疾病予防治療 製品加工』、『乳牛胚移植技術』、『豚繁殖実用技術』の責任編集に当たり、全国本科生統一編集教材『家畜繁殖学』(第三版、第四版、第五版)、北京市優良教材『家畜繁殖学』、大学院生統一編集教材『動物繁殖生物技術』の編纂に参加。家畜繁殖技術の応用と普及に積極的に従事し、2万個余りの良質肉羊、肉牛、乳牛の胚移植技術業務に参加するとともに、全国各地で関連高級技術者300人余りの訓練を実施してきた。

 クローニング技術は家畜良種繁殖及び特殊経済価値品種育成においてきわめて大きな応用潜在力を有しているため、中国政府はこれを非常に重視している。「第7次5か年計画」から「第11次5か年計画」の期間に至るまで、国家科学技術研究計画、「863」高度技術計画、「973」重点基礎研究計画などのプロジェクトは、この技術の研究に対し持続的な経費支援を行ってきた。我が国の科学者は世界の最先端に歩調を合わせるとともに、我が国の実際の状況とにらみ合わせ、たゆまぬ努力により、体細胞クローン山羊・綿羊・水牛・牛・豚・兎などの家畜を相次いで作り出している。

一、家畜体細胞クローニング技術の進展と現状

1. 牛クローニング技術

 我が国の牛核移植技術研究は比較的スタートが遅かったものの、短期間のうちに大きな進展を遂げてきた。1995年、広西農業大学は我が国初の胚細胞クローン牛を作り出した[1]。2001年、中国農業大学テーマチームはニュージーランドにおいて、卵胞顆粒層細胞核移植によって得た64の胞胚を生産し、冷凍保存したうえで中国へ持ち帰り、レシピエントの母牛体内に移植し、計4頭を妊娠させ、うち3頭は途中で流産したが、1頭は分娩期まで維持し、10月15日に深圳において生きた子牛を出産、これは我が国初の例となる体細胞クローン牛であった[2]。2001年、青島農業大学テーマチームは日本において、胎児線維芽細胞をドナー核に用いてクローン胚を生産し、山東において5頭のレシピエントに移植し、2頭を妊娠させ、順調に2頭の体細胞クローン牛を誕生させた[3]。2002年、中国農業科学院動物研究所テーマチームは、山東省曹県において成年ホルスタイン乳牛とギャロウェイ肉牛の耳上皮線維芽細胞をドナー核細胞とし、ルーシー牛の卵子を核レシピエントとして再構築胚を生産し、得られた胞胚を直接レシピエント母牛に移植し、計130頭のレシピエント母牛への移植を行い、うち26頭が妊娠し、12頭が分娩まで維持し、2002年初めに14頭のクローン牛を得ることができた[4]。同年4月、中国農業大学テーマチームは、わが国初の冀南黄牛のクローニングに成功した[5]。続いて、我が国の多くの研究機関や企業が、相次いで体細胞クローニング技術の研究を展開し、成功を収めた[6]。現在、中国大陸で生存しているクローン牛は約数百頭おり、毎年出生するクローン牛は約50頭前後に上っているが、その中には優良種牛や遺伝子組換えクローン牛が含まれている。

2. 水牛クローニング技術

 我が国の水牛クローニングの研究は主に華南地区に集中している。十年近くにわたる研究取組みを経て、2005年10月、世界初の例となる成育した体細胞クローン水牛が広西大学良種牛南方繁殖センターにおいて誕生した[7]。この基地では、毎年クローン水牛が4~5頭出生している。

3. 羊クローニング技術

 我が国は比較的早い時期からすでに山羊胚細胞核移植技術の研究を展開しており、1991年、西北農業大学テーマチームは成育した胚細胞核移植山羊を誕生させた[8]。1995年、中国科学院遺伝発育生物学研究所と揚州大学テーマチームは、山羊胚細胞継代クローニング技術の研究に取り組んだ。彼らはそれぞれ異なる発育段階にある胚割球を成熟した脱核卵母細胞に移植し、電気融合した後、それを発情同期化した山羊の輸卵管に移植して、5日後にクローン胚を回収し、8~16細胞まで正常に発育したクローン胚を選択した上で、その割球を成熟した脱核卵母細胞に移植するとともに、電気融合を行って、再クローン胚を構築し、129のクローン胚と143の再クローン胚を発情同期化した山羊の輸卵管の中に移植し、それぞれクローン山羊2頭、再クローン山羊1頭を得ることができた[9]。1999年、中国科学院遺伝発育生物学研究所テーマチームは胎児線維芽細胞を利用して、2頭の体細胞クローン山羊後代を得ることに成功した[10]。2000年、西北農業大学テーマチームは、成山羊の体細胞を核ドナーに用いてクローニング技術の研究を行い、体細胞クローン山羊を得ることができた[11]。続いて、体細胞クローニング技術は、綿羊、ボーア山羊、カシミア山羊において相次いで成功を収めた[12,13]。現在、中国大陸で生存しているクローン綿羊と山羊は百頭近くおり、毎年出生するクローン綿羊、山羊は計100頭以上にのぼるが、それらは主に遺伝子組換えクローン羊である。

4. 豚クローニング技術

 牛、羊のクローニング技術と比べて、育種・保全の方面における応用の将来性だけでなく、豚のクローニング技術はヒト疾患モデルの構築及びヒト臓器移植の方面において大きな応用の将来性を有している。とはいえ、豚のクローニング技術の中国での研究は相対的に停滞しているが、しかしここ数年は高スピードの進展を見せている。2005年、中国農業大学テーマチームは、中国初の例となるクローン豚―中国の実験用小型豚を作り出した[14]。2007年、東北農業大学テーマチームは東北民猪(訳注:中国東北地方の吉林省、黒龍江省を中心に分布している豚の品種)の体細胞クローン豚を作製した[15]。同年、上海農業科学院畜牧研究所と上海交通大学医院付属新華医院発育生物学研究センター、広西大学と広西畜牧研究所が協力して、それぞれバマミニ豚のクローン後代を作り出した[16]。2008年、中国農業大学は華南農業大学テーマチーム、WENS食品集団公司と共同で、5頭のランドレース体細胞クローン豚を作り出した。現在、中国大陸で生存しているクローン豚は数百頭おり、毎年生まれる豚は百頭近くにのぼり、その中には優良種雄豚や遺伝子ノックアウト豚が含まれている。

5. 兎クローニング技術

 兎の飼育は我が国の牧畜生産において一定の地位を占めており、同時に主要な実験動物でもある。兎クローニング技術の研究には我が国では実際、明らかな中断は見られず、早くも前世紀九十年代初めに、江蘇農業科学院と中国農業大学テーマチームがすでに我が国の胚胎クローン兎を得ることに成功している[17]。2007年、中国農業科学院北京畜牧獣医研究所は兎胎児線維芽細胞を得ることによって兎クローニング実験を行い、雌性クローン兎1匹を作製した。

二、遺伝子組換え体細胞クローニング技術

 体細胞クローニング技術は遺伝子組換え効率を高める最も有効な手段であり、我が国はこの技術を利用して遺伝子組換え家畜の研究と応用の方面で大きな進展を遂げてきた。

 1999年、中国科学院遺伝発育生物学研究所と揚州大学が共同研究を行い、クローニング技術を用いて遺伝子組換え山羊を作ることに成功した。現在、中国で毎年出生している遺伝子組換えクローン綿羊・山羊は数十頭にのぼる。

 2003年、中国農業大学テーマチームは体細胞クローニング技術を利用して、我が国初のフコース転移酵素遺伝子導入クローン牛を作り出し、続いて、リゾチーム、ヒトラクトフェリン、ヒト血清タンパク質を導入した遺伝子組換えクローン牛を作り出した。

 2006年、東北農業大学テーマチームは緑色蛍光タンパク質遺伝子組換え豚を作り出した。2008年、中国農業科学院北京畜牧獣医研究所、軍事医学科学院生物工学研究所、河北玉田種豚場玉田県牧富種猪繁育有限公司は共同で、「௰-3」脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子を導入したクローン豚を育て上げた。2008年、吉林大学農学部は世界初の例となる抗豚コレラ遺伝子をもつクローン豚を作り出した。現在、中国大陸の多くの研究機関には遺伝子組換えクローン豚、遺伝子ノックアウトクローン豚の技術プラットフォームがすでに確立されており、毎年約数十頭の遺伝子組換え豚が生まれている。

 2007年、上海交通大学医学院付属新華医院発育生物研究センターと中国農業科学院北京畜牧獣医研究所国家畜禽分子遺伝育種センターは共同で、世界初の例となる遺伝子組換えクローン兎を作り出した[18]。

三、存在する主要な問題

 現在、中国大陸で毎年出生しているクローンまたは遺伝子組換えクローン家畜は数百頭にのぼるが、この二つの技術はいまなお多くの問題とチャレンジに直面している。

技術イノベーションの不足

 我が国の家畜クローニング技術は依然として10年前のレベルをさまよっている。レシピエントの母畜胎内への移植胚数を分母とし、出生した生存仔数を分子とすると、その効率は10%に満たず、しかも出生後の死亡率は50%にも達している。主な原因はクローニング技術にこの十年間明らかな進展がなく、鍵となる部分に根本的な突破口が開かれていないことにある。ドナーには依然としてG0やG1期細胞を採用し、レシピエントは成熟卵であり、そのあとは電気融合と化学的活性化である。融合胚の胞胚発育率は体外では30~40%に達することができるが、流産率と難産率は80~90%にも達する。したがって、クローニング技術はコストが高く、経済価値を生み出すことができず、産業化の実現が非常にむずかしい。十年前、中国大陸では10社余りの営利企業がこの技術の研究開発への従事を企てたが、現在ではその大部分がすでに倒産したり生産転換を行ったりし、残っている数社は主に国の科学研究資金投入に頼って維持しており、発展を続けることが非常に困難となっている。

理論的認識が浅薄

 今日の発展水準では、操作プログラムの改善によっても家畜クローニングの効率を高めることはできない。なぜなら、クローン胚の発生・発育メカニズムは依然として一つのブラックボックスであり、関連理論に対する我々の理解は非常に限られたものだからである。細胞リプログラミングメカニズムに対する全面的認識があって初めて、我々は最も理想的な技術案を開発できるのであり、さもなければ「群盲象をなでる」ということにしかならない。知るところによれば、中国大陸にはこの方面の理論の基礎研究に従事している機関が5か所ほどあるが、ここ数年明らかな進展を遂げておらず、また、その他の機関には展開に関わる人材、財力がまったくない。全体的に言って、我々の基礎理論の研究水準には先進国に比べて5~8年の遅れがある。

研究目標の不明確さ

 中国には現在、家畜クローニング技術の研究に従事している大学及び研究所が計30余か所あり、直接参加している科学研究者は千人近くにのぼるが、これはここ数年の国の農業科学研究への高額投入のおかげである。現在、この研究陣の主な任務は地方政府または国の科学研究任務を達成することであり、大多数は他の前人の仕事の繰り返しで、将来に対する目標が明確でなく、将来の見通しも悲観的である。クローニング技術は効率があまりにも低く、短期間では産業化が実現できないため、国が現在の力の入れ方で支援を続けることは不可能であり、3~5か所の優れた機関を選んでクローニング機序の研究を支援することしかできない。したがって、安定した研究陣をいかにして維持するかということは、直面している問題の一つである。

四、我々のテーマチームが展開中の研究

 中国農業大学動物胚胎生物技術実験室は、すでに前世紀80年代に兎胚細胞クローニング技術の研究を展開しており、国内で最も早く、クローン牛・綿羊・豚の研究も展開してきた。現在、すでに、兎、牛、豚、綿羊、山羊のクローニング技術プラットフォームを確立しており、クローン胚のin vitroの胞胚発育率は40%にも達し、胚移植後の生存胎児出生率は10%前後となっている。この十年来、我々の研究は家畜の胚発生・発育の理論的基礎分野に集中しており、主に以下のいくつかの方面で研究を展開している。

1. 卵子の老化メカニズム

 卵子は体細胞リプログラミング及び、初期胚発育のサポートの物質的基礎である。実際には、卵子はMⅡ期に入ると急速に老化し、胚発育力の低下をもたらす。我々の研究結果によれば、卵子の老化は主として卵細胞質内の活性酸素種(ROS)の蓄積によってもたらされる。卵子は成熟後12時間で、細胞質内のROS濃度が明らかに上昇し、それによって小胞体の構造に変化が発生し、それが貯蔵しているCa2+の流出をもたらす。その結果、卵子のカルシウム放出能力が低下し、受精または単為生殖後に正常な胚発育をスタートすることができなくなる。反対に、細胞質内の高すぎる遊離カルシウムは卵子のアポトーシスプログラムをスタートさせることになる。

2. 培養条件が初期胚発育に与える影響

 胚の培養環境はその後期発育に直接影響を与えるが、この影響の分子基盤はなんであろうか。我々は現在、酸化ストレス、温度ストレス、培養液活性高分子の初期胚発育に対する影響という方面から、高度なシーケンシングとエピジェネティクス解析を利用して、外界要因が胚発育に影響を与える分子メカニズムを解明しているところである。

3. 反芻動物の胚伸長メカニズム

 牛、羊など反芻動物の胚伸長は子宮への移植を完成させるための必要条件である。in vitroで生産した胚を移植した後の受胎率は体内胚のわずか50%にすきないが、それは主に、母体の妊娠識別と胚移植の失敗によって引き起こされる。同じ移植レシピエントになぜこのような差が現れるのであろうか。それは、in vitro 胚の発育の遅れと移植前の伸長不足が主因となっている可能性がある。我々は現在、成長因子レシピエントとインテグリン遺伝子の発現レベルから、この種の遺伝子機能に対する体内・外界環境の影響について研究を行っているところである。

4. 胚細胞の冷凍損傷メカニズム

 冷凍保存は胚バイオテクノロジーに欠かすことのできない部分であるが、冷凍解凍胚の受胎率は新鮮な胚に比べて10~15%低下し、また、in vitroで生産した胚では30~40%前後も低くなっている。どのような原因が冷凍解凍胚の発育潜在力の低下を招いているのであろうか。我々は現在、胚の細胞小器官、たとえばミトコンドリア、小胞体、脂質等といった超微細構造から着手して、ROS、アデノシン3リン酸(ATP)、グルタチオン(GSH)等といった鍵となる生物分子の活性の分析を通じて、低温処理の胚遺伝子発現及び高分子活性物質に対する影響を研究し、より高効率の胚冷凍技術の研究を目指しているところである。

5. 家畜クローニング効率を高める新技術

 クローン胚の流産率と対峙死亡率が高い原因はなんであろうか。これまでの研究基盤と結び付けて、我々はクローニング方法の改善と、エピジェネティックな異常の抑制という二つの方面を突破口とし、体外受精胚を参照対象とし、胞胚期のキー遺伝子の発現レベルを調整することによって、細胞リプログラミングの乱れを克服し、クローニング効率を高めようとしている。

主要参考文献:

  1. 甘岑,蒙少宁. 我国第一头“克隆”牛诞生始末.农家之友;1998年07期。
  2. 安晓荣,苟克勉,朱士恩,关宏,侯键,林爱星,曾申明,田见晖和陈永福.卵丘细胞核移植技术生产克隆牛犊. 中国科学(C辑),2002,32(1):69-76.
  3. 董雅娟,柏学进,等. 应用负压气相培养系统生产体细胞克隆牛的研究.中国农业科学, 2002,35(8):988—994.
  4. 陈大元,李劲松,韩之明,孙青原,等. 体细胞克隆牛: 供体细胞和受体的影响. 科学通报, 2003, 48(8):768-773.
  5. DAI Yunping, LIAN Zhengxing, ZHU Huabin,et al. Clone of Chinese Jinan red-cross yellow cattle and valuation of reproductive characteristics of cloned calf. Chinese Science Bulletin, 2005 Vol. 50 No. 22 2592-2597.
  6. 邓守龙,彭 涛,吕自力,等. 体细胞克隆牛的研究进展.新疆畜牧业,2008,3,4-7.
  7. Deshun Shi, Fenghua Lu, Yingming Wei, Kuiqing Cui, Sufang Yang, Jingwei Wei, and Qingyou Liu. Buffalos (Bubalus bubalis) Cloned by Nuclear Transfer of Somatic Cells. Bio. Reprod. 77, 285–291 (2007).
  8. Zhang Yong, Qian Jufen and Liu Ling. Development in vitro of goat nuclear transplanted embryos. Theriogenology, 37(1):329, 1992.
  9. 邹贤刚,李光三,王玉阁,等.山羊(Carpra hircus)胚胎细胞经继代细胞核移植后其发育能力的研究. 科学通报, 1995,40:264-267.
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  11. 郭继彤,安志兴,李 煜,等. 成年耳细胞克隆山羊(Capra hircus). 中国科学(C辑),2002,32(1):77-83.
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  13. 王申元,周欢敏,张 立,刘俊平,等. 不同处理方法对绵羊克隆胚胎的移植比较研究.黑龙江畜牧兽医(科技版),2010,1,51-52.
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  15. 刘忠华,田江天,郑重,等. 体细胞核移植克隆民猪:培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响.中国科学(C辑),2005,35(5):439-445.
  16. 卢晟盛,吕培茹,刘红波,何若钢,等. 广西巴马小型猪克隆胚胎的构建及胚胎移植.动物医学杂志,2006,15(2),101-105.
  17. 刘林. 核移植克隆兔胚胎的研究.博士论文.北京农业大学,1993.
  18. Shangang Li, Yi Gou , Fengying Xing, Zhenfu Fang,Yao Li, Lixin Du, Xuejin Chen. Transgene expression of green fluorescent protein in cloned rabbits generated from in vitro transfected adult fibroblasts. Transgenic Res. 2009 (18):227–235.

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