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食品検査におけるバイオチップの応用の進展(その1)

2018年6月6日

苗 小草: 乳業生物技術国家重点実験室,上海乳業生物工程技術研究中心,光明乳業股份有限公司乳業研究院,上海大学生命科学学院

修士課程大学院生。研究テーマは食品安全。

陳 万義、游 春苹:  乳業生物技術国家重点実験室,上海乳業生物工程技術研究中心,光明乳業股份有限公司乳業研究院

張 娟: 上海大学生命科学学院

概要:

 バイオチップ技術は、各国が重点的に発展させている新興技術であり、食品研究分野で幅広く応用されている。本稿は、バイオチップの基本原理を簡単に紹介し、バイオチップの食品安全分野での応用を論じた。これには病原微生物や生体毒素、残留農獣薬、違法添加物、偽物、遺伝子組み換え食品、食品アレルゲンなど各種の検出が含まれる。さらに食品安全検査や毒性学、栄養健康分析におけるバイオチップの応用や、この技術に存在する問題、未来の発展の見通しを簡潔に論じた。

キーワード:バイオチップ;食品安全;検出

序言

 現在、食品安全問題は世界でますます重視されつつある。中毒現象を頻発する食品やリコール事件を起こした食物の品質の改善にも、栄養や健康に対する人々の日増しに高まるニーズを満たすためにも、科学技術のさらなる革新と力強い下支えが必要となる。これは各種の食品のハイテク検査技術の絶え間ない進歩を促しており、1980年代のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)からその後の蛍光定量PCRまで、各種の新たな分子生物技術が食品検査に徐々に応用され始めている。

 バイオチップは1990年代、まったく新しいバイオ技術として成熟し始め、大きく発展し始めた。この技術には、ハイスループットや微量化、自動化などの特徴がある[1]。チップ技術の急速な発展に伴い、バイオチップは、医療分野[2]や農業分野[3]、国防分野[4]でいずれも進展を実現している。本稿では、バイオチップの基本原理を簡単に紹介し、バイオチップの食品安全や、栄養と品質の検査での応用を詳しく紹介する。

1 バイオチップ概説

 バイオチップ技術は、総合的なハイテクノロジーであり、生物学や化学、医学、物理学、材料学、電子技術、生命情報科学、精密機器などをカバーした学際研究分野である。バイオチップ(biochip)とは、標識したバイオプローブを基板(シリコンウェハーやスライドガラス、高分子ポリマー薄片)上に並べて固定し、検査サンプルと基板上のプローブに特異的親和性反応が起こった後、スキャンとコンピューターソフトウエアを通じて各プローブ上の標識信号を分析し、DNAやRNA、ポリペプチド、タンパク質などの生体物質の検出を完了するものだ[5-7]。遺伝子チップとタンパク質チップ、ラボオンチップの3つの分野に大きく分けられる。遺伝子チップ[8]は、サンプルとプローブの間の遺伝子の塩基対合則を利用し、ハイブリダイゼーションを行う。タンパク質チップ[9]は、抗体と抗原の間の特異性免疫の原理を利用する。ラボオンチップ[10]は、各種のバイオチップを一体化したバイオ分析システムであり、使いやすくスピーディー、効率的で携帯性も高く、未来のバイオチップの発展方向とみなされている。タンパク質チップとラボオンチップに比べると、遺伝子チップの応用範囲はより広く、普及度はより高い。

 バイオチップは、微量生化学分析の土台であり、従来の分析方法と比べると、▽各種の分析物を同一のサンプル上で同時に研究できる▽必要なサンプル量が少ない▽貴重な試薬の消耗量が低い▽高度微量化▽ハイスループット――などの優位性を持っている[5]。疾病の診断と治療、薬物のスクリーニング、農作物の優良品種の育成、食品検査、環境検査、国防などの分野に幅広く応用できる。総じて、生命活動にかかわる分野で、バイオチップは大きな応用の見通しを持っている。

 バイオチップの製造に必要な基板材料は固体のプレート状または膜でなければならない。ガラスは簡単に入手でき低蛍光であるため、ガラスプレートが最もよく用いられる基板材料とされる。通常、活性遺伝子を基板のガラスプレート上に連結する。遺伝子チップを例に取ると、その製作技術は主に、チップ製造、サンプルの製造とハイブリダイゼーション、チップの検査と分析の3ステップからなる[11]。そのうちチップ製造は、その場での合成と事前合成後のサンプル添加を含む[12]

2 食品安全検査におけるバイオチップの応用

 中国の食品産業の安全問題は日増しに際立っている。伝統的な検査方式は、さまざまな偽物などの問題に対処するには立ち遅れている。多くの方法は指向性が低く、多くの種類の物質の検出ができない。またはかかる時間が長すぎ、現場でのスピーディーな検査に使えない。バイオチップは、企業のよりしっかりとした検収にも、監管当局の厳格な監督管理と消費者の利益の保護にも役立ち、その開発は急務となっている。

2.1 食品由来病原微生物の検出

 栄養の豊富な食品の多くは、微生物にとっての良好な培地となる。農地から食卓までのすべての過程で食品の微生物汚染は起こり得る。伝統的な微生物検出には主に、酵素結合免疫吸着(ELISA)技術[13]とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術[14]がある。だがELISA法は、繰り返し精度が低く、自身の抗体の干渉で偽陽性が出現しやすい。PCRは、多くのウイルスの検査が難しく、容易に汚染され、偽陽性を出しやすい[15]。バイオチップのハイスループットや高感度、高特異性などの強みは、伝統的な検査方法とは比較にならない[16-17]

 Huang[18]は、アレイ式CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)生体電気信号センサチップとポリメラーゼバイオチップの光学酵素検査システムによる病原性大腸菌の測定を打ち出した。この測定方法では、4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルクロニドを蛍光基質とし、0.1U/mLのβ-グルクロニダーゼを検出した。これは約106CFU/mLの大腸菌細胞に相当する。この発光酵素検査システムは感度が高くスピーディーである。Tachibanaら[19]は、病原微生物を定量測定できる使い捨ての自動マイクロ流体制御PCRプラスチックチップを発明した。汎用性を実現するため、研究者は、シクロアルケンポリマーをチップの基体とした。このPCRチップによる人体と大腸菌、病原性大腸菌O157のDNA最低検出限界はそれぞれ4、0.0019、0.031pg/μLで、いずれも18分以内の検出が可能。この研究は、スピーディーで操作がしやすく、コストも低いPCR測定方法を提供した。Manzanoら[20]は、ディープブルーの有機発光ダイオードに基づく小型高感度DNAチップを設計した。蛍光共役のDNAプローブを刺激するためダイオードの分子設計を最適化し、高い感度と特異性を獲得するため本物の肉類サンプルを用いて測定した。最後に古典的な平板法と分子生物学的方法を用いてDNAチップの取得した結果を検証した。この有機発光ダイオードチップの最低検出限界は0.37ng/μLで、24時間以内に必要な結果が得られる。

 Kooら[21]は、マイクロ流体チップ[22-23]による病原微生物の精確な測定の前提条件は、バイオセンサー上に目標物を効率的に捕獲することだと論じた。研究者らは、ビオチンによって標識された熱ショックタンパク質を捕獲分子とし、マイクロ流体環境でリステリア・モノサイトゲネスを測定した。さらに孵化時に5分の誘電泳動力を加えると、熱ショックタンパク質の捕獲率を60%高められることを発見した。Eomら[24]は、7種の食品由来病原体を選び、彼らの発明したオリゴヌクレオチドに基づくチップ検査システムを用いて、病原体に対する各自の16S rDNAの特定の配列を評価した。さらに開発した二次元可視化ツールを用いて結果を検証し、このシステムを多くの種類の病原体の検査測定に用いることができることを証明した。Ikedaら[25]は、急速マイクロビーズ法で病原性細菌を検査測定するマイクロ流体チップシステムを開発した。研究者らは、4種の細菌(大腸菌、サルモネラ、エルシニア・エンテロコリチカ、セレウス菌)を食品由来病原性菌の代表的な菌種として選んだ。このシステムは、5つのオリゴヌクレオチドプローブに対応した目標細菌の16S rRNAと蛍光マイクロビーズを結合し、4種の細菌から取り出したRNAを蛍光標識し、固定化したオリゴヌクレオチドプローブの蛍光マイクロビーズとハイブリダイゼーションした。マイクロ流体チップシステムを用いて、複式RNAとマイクロビーズを分析し、3時間後には結果を得た。

2.2 生体毒素の検出

 正常な状況下では、人体は、一部の微量な毒素を分解・排除し、自身の健康を維持する能力を持っている。均衡がいったん破られると、体内の毒素は、早期の除去ができず、蓄積され、人体は亜健康状態に陥り、多くの種類の疾病が引き起こされる。生体毒素の検出は欠かすことができない。

 Pennacchioら[26]は、表面プラズモン共鳴バイオチップを通じてパツリン毒素を検出した[27]。パツリンは、アオカビとクロコウジカビ真菌の有毒な二次代謝産物であり、胃潰瘍と腸炎を引き起こし、しばしば風邪薬に存在する。伝統的な検出方式には効果な分析機器が必要だった。この研究は、新たな競合免疫測定方法による風邪薬の測定を打ち出した。実験において重要な測定方式は表面プラズモン共鳴光学技術である。レーザー誘導バイオチップの表面金属付近のプローブと目標分子は相互に作用し、微妙に変わる反射率を容易に測定し、パツリン毒素を検査測定することができる。Rubinaら[28]は、ヒドロゲルバイオチップを用いて、7種の黄色ブドウ球菌腸毒素(A、B、C1、D、E、G、I)を同時に検査測定した。この方法はまず、純化された組み換え毒素を発現し、抗毒素のモノクローナル抗体を算出する。モノクローナル抗体と最良の毒素抗体をスクリーニングできるバイオチップを設計・製造する。最後に毒素を定量分析できる診断バイオチップをさらに設計する。チップ表面に金属コーティングを施せば、2時間の検査測定時間の短縮が可能となる。

 Pandeyら[29]は、出芽酵母全細胞型静電容量式バイオチップを用いて、異なる形式のカーボンナノチューブの毒性を検査測定した。このチップを、異なる濃度の単層・多層・二層カーボンナノチューブに設置し、交流周波数の下、動的細胞表面電荷分布相対電気容量の変化を測定した。このチップはカーボンナノチューブの吸着力と大きく関係している。先進国が生産するこのチップは、食品と環境のサンプルのハイスループットスクリーニングに用いることができる。Ahnら[30]は、遺伝子毒性細胞アレイチップを構築し、遺伝毒性試験を行った。8つの組み換え発光細菌が、遺伝子毒性細胞アレイチップの製作に用いることに成功し、4つの明らかに化学的ダメージを受けたDNAを用いてチップの機能を検証した。遺伝毒性作用の具体的なプロセスに基づき、各チップの菌株はどれも明らかな反応を示した。このチップは、食品や薬物、環境中の未知の物質の遺伝毒性のメカニズムの研究に用いることができる。Jimenaら[31]は、自動化マイクロアレイチップを用いて、生コーヒー中のオクラトキシンAを抽出し、化学発光検査法を用いて再生可能免疫バイオチップによってスクリーニングされたオクラトキシンAを検査した。研究者らは、コンタクトプリンティングを通じて、ガラスチップ上に共有結合固定した、水溶性ペプチドと共役カルボキシル化したオクラトキシンAを合成した。このチップは、間接競合免疫を用いてオクラトキシンAを測定できる。

2.3 残留農獣薬の検出

 いかなる食品中の残留抗生物質も食品の品質に深刻に影響する。抗生物質の摂取は、体内の善玉菌を抑制し、病原性菌の薬剤耐性を生む[32]。「抗生物質フリーミルク」は、国際的に通用する原料ミルクの調達標準であり、その他の食品にも抗生物質を制限する標準がある。

 Gaudinら[33]は、欧州で標準となっている動物用医薬品残留の検査方法に基づき、バイオチップ技術を用いて、6種の蜂蜜中の抗生物質を検査した。蜂蜜には、抗生物質の最大残留制限の標準がない。Gaudinは、2007年に出版された欧州連合(EU)標準実験室の制御方法と分析性能のうちの蜂蜜中の抗生物質残留制御に関するストラテジーを参考にして、競合化学発光免疫分析を用いて抗菌薬物を検査測定した。特異性は優良で、異なる種類の蜂蜜への使用に適していた。蜂蜜中の抗生物質の測定ではさらに、Mahonyら[34]が、化学発光的バイオチップアレイセンサー技術を用いて、蜂蜜中のニトロフラン類抗生物質の残留を測定した。マルチプレキシングの方法を用いると、4つの主要なニトロフラン類抗生物質の代謝物を同時に検査測定できる。最後に、高効率の液体クロマトグラフィーの二段質量分析を用いて、測定結果を検証した。このバイオセンサー法は、発展の潜在力を備えており、食品安全面の目的スクリーニング技術として用いることができる。

 Klothら[35]は、間接競合化学発光免疫チップ法を設計した。牛乳中の13種の抗生物質の含有量を数分で同時に測定できる。研究者らは、複数のステップによる基体の化学処理を行った後、最終的に、ガラスプレート表面にエポキシ樹脂の活性化したPEG層を修飾し、スルホンアミド系、β-ラクタム系、アミノグリコシド系、キノロン系などの誘導体を加入し、エポキシ樹脂と直接の共有結合を行った。この方法は感度が比較的高い上、繰り返し50回使用でき、測定の安定性と利便性を高めただけでなく、基体を新たに製造するコストを削減した。

その2へつづく)

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※本稿は苗小草,陳万義,張娟,游春苹「生物芯片在食品検測中的応用進展」(『河南工業大学学報(自然科学版)』2017年第38 卷第1 期、pp.114-121)を『河南工業大学学報(自然科学版)』編集部の許可を得て日本語訳/転載したものである。記事提供:同方知網(北京)技術有限公司


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