トリプトファンtRNA及びトリプトフィルtRNA合成酵素の種特異性の研究

（上海大学生命科学学院 教授・中国科学院上海生命科学研究院生物化学・細胞生物学研究所）　2010年 5月19日

金由辛（JIN Youxin）：
上海大学生命科学学院 教授・中国科学院上海生命科学研究院生物化学・細胞生物学研究所テーマグループ・リーダー（研究員）

1944年2月生まれ。1966年、南京大学生物化学科を卒業し、農業部農業生物研究所において1978年まで環境保護の研究に従事。1981年、中国科学院上海生物化学研究所生物化学科大学院卒業（修士）後、同所にとどまり現在まで勤務。2010年1月より上海大学生命科学学院教授。長くRNA分野の研究に従事、その重点はtRNAとaaRSの構造・機能研究、小分子コントロールRNAと核酸のバイオ技術応用にある。発表研究論文110編（被引用600回）、専門著作1冊『RNAとRNAのゲノミクス』、2005、科学出版社、北京、pp232。発明特許4件を取得。2002年、中国生物化学・分子生物学会RNA専門委員会を設立し、現在まで主任を務める。現在、上海生物化学・分子生物学会理事長を務める。中国人民政治協商会議上海市第9期委員会委員（1998～2003）及び第10期委員会常任委員（2003～2008）を歴任。

　アミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）と基質tRNAの識別は、たんぱく質生合成プロセスにおける重要なステップであり、その識別の正確性は生物の生死の問題と直接関わっている。いくつかのアミノアシルtRNA合成酵素と基質の識別には種特異性が存在している。例えば、枯草菌トリプトフィルtRNA合成酵素（TrpRS）は枯草菌トリプトファンtRNA（tRNATrp）しか識別できず、ヒトtRNATrpを識別することはできない。ヒトTrpRSは同様にヒトのtRNATrpだけを識別することができ、枯草菌のtRNATrpを識別することはできない。このことは、われわれが低毒広域スペクトル抗生物質を設計するためのチャンスを与えてくれた。

　1988年、香港科技大学の王子暉らは枯草菌（Bacillus subtilis）の中からTrpRSをクローン化するとともに、それについてシークエンシングを行い、1990年にはさらに大腸菌において枯草菌TrpRSを高発現させた。1992年、アメリカYale大学のD.SollはトリプトファンtRNAのアイデンティテイ・エレメントの研究を開始するとともに、tRNAのアイデンティテイを反転しようと企図。1995年、原核TrpRSの結晶構造分析によって、それと原核チロシルtRNA合成酵素の構造の驚くべき相似を発見した。2000年、一種の耐熱性枯草菌（Bstearothermophilus）のTrpRS高解像度（2.9A）結晶構造が析出された。

　当研究室は王子暉、薛紅両教授の強力な援助（枯草菌TrpRs、tRNATrp及びウシtRNATrpの組み換え細菌、複数ロットのヒトTrpRS製剤を提供していただいた）の下、1997年、tRNATrp及びTrpRSの種特異性の問題について研究を開始した。

図1　枯草菌TrpRSのホモロジーモデリング図

（文献[8]より）

　香港から送られて来る純化したTrpRSはしばしば行程の遠さのせいで失活しているため、そこで我々はヒトtrpS遺伝子をpET-24a（+）プラスミドにクローン化し、直接、大腸菌―BL21-CodonPlus（DE3）-RIL菌株（フランスCNRS H.Grosjean教授恵贈）中に発現させ、Ni-NTAワンステップ純化法によって、純化したヒトTrpRSを大規模に、廉価に、高い品質で発現させ、この事業の展開のために条件を作り出した。

　tRNATrpの種特異性エレメントについて研究するため、我々はまず初めに耐熱性枯草菌の結晶構造データに基づき、枯草菌のTrpRsについてコンピュータによるホモロジーモデリングを行った。図1は枯草菌TrpRSとtRNATrpのアンチコドンドメイン及びアクセプタ・ステムの結合を示したものである。真核、原核と古細菌tRNATrpは、いずれも同じアンチコドンを有している。そのためtRNATrpの種特異性のエレメントはアクセプタ・ステム領域にしか存在することができない。

　我々は3界の生物起源のtRNATrpアクセプタ・ステムの配列を比較し、3'‐第4位、すなわち73位のヌクレオチドとアクセプタ・ステムの1位と72位の間の塩基対に明らかな種の違いがあるのを発見した。原核と真核のtRNATrpにおいては、この3つのヌクレオチドは各々が非常に保守的だが、完全に異なってもいる。たとえば、原核tRNATrpの73位はGヌクレオシドで、1番目の塩基対はAUである。一方、真核tRNATrpにおいては、それらはそれぞれAとGC対である。また、原核tRNATrpの5番目の塩基対も非常に保守的で、GC対である。一方、真核tRNATrpにおいては主としてCG対である。

図2　10種のtRNATrpアクセプタ・ステムの配列の比較図

すべての既知のtRNATrpはどれもこの法則に合致している。それらは次の通り。
B-Bs, B. subtilis; B-Ec, E.Coli; B-Hi, H.infuluenzae,; B-Rp, R.Prowazekii; B-Uu, U.urealyticum;
A-Hv, H.volcanii; A-Af.A.fulgidus; E-Hs, H.sapiens; E-Sc, S.cerevisiae; E-Ye, yeast。文献[9]より。

　上記の分析に基づき、我々は3つの枯草菌tRNATrp変種―G73A、（すなわち73位のGをAに突然変異させた。以下同じ）、G73A・A1G/U72C、 G73A・A1G/U72C・G5C/C68Gを構築した。同様に、ヒトtRNATrpのA73G、 A73G・G1A/C72U、A73/G・G1A/C72U・U5G/G68Cの3つの変種を構築した。然る後に、それぞれ枯草菌TrpRSとヒトTrpRSを用いてすべての野生型及び変異tRNATrpの動力学的常数を測定した。結果は表1の通りである。

　上の表からわかるように、原核tRNATrpは真核の方向へ73位が突然変異すると、原核TrpRSによって識別される能力が1%以下まで低下した。原核tRNATrpは真核の方向へ73位と1番目、5番目の2つの塩基対が突然変異すると、真核TrpRSによって識別される能力が真核tRNATrpの75%前後にまで上昇した。すなわち、その種特異性はすでに反転させられていた。真核tRNATrpは原核の方向へ73位が突然変異すると、真核TrpRsによって識別される能力が7.5%まで低下した。また、真核tRNATrpは原核の方向へ73位と1番目、5番目の2つの塩基対が突然変異すると、原核TrpRSによって識別される能力が原核tRNATrpの14%前後にまで上昇し、すなわち、その種特異性は部分的にしか反転させられていない。したがって、原核TrpRSのtRNATrpに対する識別は、真核TrpRSのtRNATrpに対する識別よりも厳格であると考えることができる。これは非常に興味深い現象である。原核tRNATrpの中にはより多くの種特異性エレメントが存在しているのである。

　枯草菌中のその他の種特異性エレメントを探し出すさらに多くの手がかりがないため、我々は体外スクリーニングの方法（SELEX、systematic evolution of ligands by exponential enrichment)）を採用して、枯草菌のTrpRSを固相化した。20個のランダム配列を含むDNAデータベースを構築し、ランダム配列上にはT7 RNAポリメラーゼのプロモーターが動いており、下流配列はRT-PCRのプライマーとすることができる。ランダムDNAデータベースを用いて420種の異なる配列 を含むRNAデータベースを転写し、これらのRNAと固相化したTrpRS（両者のモル比は10：1）を22℃で30分間インキュベートした。TrpRSに特異的に結合されることができた分子はよりうまく残しておくことができ、特異的に結合されることができなかった分子はより簡単に洗い落とされる。十分に洗浄した後、フェノール抽出の方法を用い、TrpRSに結合されたRNAを回収する。RT-PCRが初めて濃縮された後のDNAデータベースを通じて、2つ目のRNAデータベースが転写される。固相化したTrpRSとの結合、洗浄、回収、RT-PCR、体外転写を繰り返せば、TrpRSと特異的に結合したRNA分子を濃縮することができる。3回にわたるスクリーニングを経た後、RNAデータベースのシークエンシングでCCCの特異的バンドが出現しているのを発見した（図1参照）。枯草菌tRNATrpの配列と対照して、それは2-4の3つのGC対の領域に対応していることに気づいた。上記と類似した突然変異の方法を用いて、ヒトtRNAは原核の方向へ73位と1-5対の塩基対が突然変異すると、枯草菌TrpRSによる識別が枯草菌tRNATrpの63%にしか達さず、種特異性が反転させられることを証明した。図4はtRNATrpの種特異性エレメントを示したものである。

図3　最初のデータベースと3回のスクリーニングを経た後の配列の比較

オリジナルのデータベースには20個のランダム配列があるが、スクリーニングを3回経た後のランダム配列の中には2個のCがあり、
ランダム配列外の1個のCを加えて、CCC配列の存在があることに注意されたい（文献10より抜粋引用）。

図4　tRNATrpの種特異性エレメント

tRNATrp中の最も主要な種特異性エレメントは3'‐第4位のヌクレオチド（73位、赤色標示領域）である。サブエレメントは1番目と5番目の塩基対（黄色標示領域）であり、
枯草菌tRNATrpにおいては主要及びサブエレメントが同時に突然変異し、すなわちヒトTrpRSによって75%前後もアミノアシル化されることができる。
同様に、ヒトtRNATrpのA73Gが突然変異し、すなわちヒトTrpRSによって識別される能力がほぼ完全に失われ、主要及びサブエレメントが同時に突然変異し、
枯草菌TrpRSにより14%もアミノアシル化されることができる。原核tRNATrp中にはさらに3つ目の種特異性エレメントがある（緑色標示領域）。

　その後、我々はTrpRS分子中の種特異性エレメントを探し始めた。同様に、枯草菌のTrpRSホモロジーモデリングの中から、Rossmannフォールドドメインのトリプトファン結合部位のすぐ近くにある108-122領域とtRNATrpアクセプタ・ステムの結合、SD構造域にある234-238領域とアンチコドン・ループの結合を推測することができた。我々は108-122領域と234-238領域が別々に、または同時に欠失した3つの変種TrpRSを構築し、アクセプタ・ステムとTステム・ループから成る小螺旋及びアンチコドン・ステム・ループから成る微細螺旋を合成した。それぞれP32で表記される小螺旋と微細螺旋及び3種類の変異酵素と野生型酵素を用いてGel retardation実験を行った。その結果、アクセプタ・ステムは野生型TrpRS及び234-238の欠失した変異酵素としか結合できないこと。また、アンチコドン・ステム・ループは野生型酵素及び108-122の欠失した変異酵素としか結合できないことが実証された。我々はさらに当該のホモロジーモデリング図中のトリプトファン結合ポケットに近い1つのモジュール（149-153）を検査。枯草菌TrpRsの多くの変異酵素―K149R、K149E、K149G、E153D、E153K、E153G、K149E/E153Kを構築し、野生型枯草菌TrpRS、野生型ヒトTrpRS、各種変異酵素をそれぞれ用いて枯草菌とヒトのtRNATrpのアミノアシル化活性を測定した。結果は表2の通りだが、アルカリ性アミノ酸K149を酸性アミノ酸Eに改めた後、枯草菌の野生型TrpRSと比べると、そのアミノアシル化した枯草菌tRNATrpの活性は56%に低下し、アミノアシル化したヒトtRNATrpの活性は13.5倍に上昇していた。酸性アミノ酸E153をアルカリ性アミノ酸Kに改めると、そのアミノアシル化した枯草菌tRNATrpの活性は3%に低下し、アミノアシル化したヒトtRNATrpの活性は12.9倍に上昇していた。一方、この2つのアミノ酸の二重変異酵素（K149E/E153K）と枯草菌の野生型TrpRSを比べると、そのアミノアシル化した枯草菌tRNATrpの活性は1%に低下し、アミノアシル化したヒトtRNATrpの活性は30.7倍に上昇していた。結果が示しているように、K149とE153は枯草菌TrpRS分子中の種特異性エレメントである。

表2　異なるTrpRSを用いて測定した枯草菌及びヒトtRNATrpのアミノアシル化活性 文献[12]より

図5　枯草菌TrpRSとtRNATrpが結合したときのシミュレーション図 文献[12]より

K149はG73に接近し（tRNATrpの種特異性エレメント）、E153はA1-U72塩基対に接近している（同じくtRNATrpの種特異性エレメント）。文献[12]より。

　我々は同様にヒトTrpRSについて研究を行い、枯草菌TrpRS 149-153位に対応するモジュール（Lys149 XXX Glu153）、ヒトTrpRSの314-318位を含むモジュール（Asp314 XXX Arg318）を発見した。両者の区別は、前者はアルカリ性アミノ酸が先で、酸性アミノ酸が後であり、後者は酸性アミノ酸が先で、アルカリ性アミノ酸が後だという点にある。それらについて上記と似た突然変異実験を行ったところ、結果は原核TrpRSの結果と同じであった（未発表資料。大会報告。国際アミノアシルtRNA合成酵素会議、ソウル、7月4～9、2004）。

　種特異性の問題をさらに深く理解するために、我々は同じ研究所の丁建教授と共同研究を行い、2004～2006年にかけて、ヒトTrpRS、ヒトTrpRS‐ウシtRNATrp複合体の結晶構造を完成させた。我々と同時期にヒトTrpRSの結晶構造作業を完成させたのは、日本の濡木 理研究室とアメリカのP. Schimmel研究室であり、我々と同時期にヒトTrpRS‐ウシtRNATrp複合体の結晶構造分析を成し遂げたのはアメリカのP. Schimmel研究室であった。

　我々は多波長不規則回折法を用いて、短縮したTrpRS（T2-hTrpRS）の結晶構造を析出し、解像度は2.5Aであった。当該酵素はアミノアシル化触媒段階を含んでおり、かつ大部分の血管新生促進活性を具えている。当該酵素と枯草菌TrpRSの配列のホモロジーは22%に過ぎない。だが、それらの完全な立体構造は驚くほど似通っている。ヒトと枯草菌の2種類のTrpRSを比較すると、両者の間には基質結合ポケット上ならびに結合基質とtRNAに対して重要な役割を果たす入口箇所に、ともに実質的な相違の存在することがわかった。このような結果は、哺乳類のTrpRSと細菌のTrpRSは、基質を識別するメカニズムが同じではないということを暗示している。研究が示しているように、1個のtRNAはアクセプタ・ステムを通じてリンカー1と結合し、アンチコドン・ループとa螺旋が結合する方式によって、TrpRSの2個のサブユニットと結合する。我々の結果はさらに、血管新生促進活性はa螺旋構造域にある可能性があり、それは短鎖の細胞因子として組み立てられているということを暗示している。

図6　TrpRSがtRNATrpの種特異性エレメント（A73、G72-G1）に

結合した部位を示す細部構造図（文献[15]より）

　ウシtRNATrp‐ヒトTrpRS複合体の結晶構造は中国で初の核酸‐蛋白質複合体の結晶構造である。我々は、以前に予測していた部位のモジュール（Asp314 XXX Arg318）とは異なる別のTrpRSとtRNATrpの結合した部位―モジュール（Asp99 XX Lys102）を発見した。ヒトTrpRSの突然変異・活性検査の実験を経て、このモジュールは間違いなくヒトTrpRS‐ウシtRNATrpの識別に対して影響があることを証明した。TrpRSによるtRNATrpの識別メカニズムにとっての新たな問題、すなわち、なぜTrpRSにはtRNATrpと結合する2つの部位がなければならないのか、という問題を提起したのである。TrpRSがtRNATrpを識別する過程は、とりもなおさずTrpRSがtRNATrp上の2つの部位と結合するステップである。そして、われわれが予測した部位はアメリカ科学アカデミー会員Shimmelの研究室の結晶構造によって実証されたのである。

図7　A. TrpRSとtRNATrpの相互作用の立体図
B. 真核生物におけるA73とR318の間の水素結合
C. 原核生物におけるG73とE153の間の水素結合（文献[17]より）

　我々のTrpRSとtRNATrpの種特異性に関する研究結果が明らかに示しているように、TrpRSは広域スペクトル殺菌剤のスクリーニングの標的とすることができる。当研究室はこの種特異性を利用して広域スペクトル殺菌剤のスクリーニングを行う研究を進めているところである。