ミトコンドリアはタンパク質チオールの酸化修飾に中心的な役割を担う

2010年 5月27日

楊弋（Yang Yi）：華東理工大学特別客員教授

1973年4月生まれ。1999年清華大学生物科学とバイオテクノロジー専攻。哲学博士。1994-1999 清華大学 生物科学と技術系分子酵素学実験室において、タンパク質のスルフヒドリル基修飾、および亜鉛における酵素の構造と機能に対する影響を研究。1999-2002 ハーバード医科大学院 生物化学・生物物理・医学センターにおいて、リサーチフェロー（Research fellow）として、金属タンパク質の機能研究に従事する。2002-2005 さらに、ボストン医科大学院 心臓血管研究センター、およびエバンスメディカルセンターにおいて、博士研究員(Research Associate) として、一酸化窒素遊離基の生物学、タンパク質スルフヒドリルグループ、および心臓血管疾患に研究を進める。2005-2006 ハーバード医科大学院、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院において、生物化学の副研究員および医学講師(Associate Biochemist & Instructor of Medicine)を勤める。継続して上記の一酸化窒素遊離基の生物学、タンパク質スルフヒドリルグループおよび心臓血管疾患を研究。2006-現在　華東理工大学特別客員教授。

主な研究成果：

主に、タンパク質のスルフヒドリル基酸化的修飾についての細胞内in-situ画像技術において実績を上げる。スルフヒドリル基修飾は、酸化還元シグナル伝達研究における世界的なホットスポットであるにも関わらず、長期にわたり分析技術が伴わないため研究が非常に困難であるとされてきた。私は、タンパク質ニトロソ化と、ジスルフィド結合の細胞内in-situ画像という、2種類の重要なタンパク質のスルフヒドリル基酸化的修飾についての技術を確立した。世界初の、細胞内におけるタンパク質のニトロソ化in-situ蛍光ラベリング画像を得たうえ、ミトコンドリアにおけるこれらの修飾を観測し、画像構築の方法によって細胞内のジスルフィド結合の位置とレベルを観察することに成功した。以上の技術は、スルフヒドリル基酸化的修飾研究における障害も解消し、更に研究を進め、これらの修飾の細胞内における定位と調整機能を示した。ニトロソ化の形成メカニズム、および細胞がタンパク質のジスルフィド結合を調整することによってタンパク質の機能を調整するという仮説を提出し、その複雑な生命活動と疾病における作用をさらに示すため、新たな発想を提供した。

要約

　チオールはタンパク質の酸化・還元状態を適切に維持するために主要な役割を担っている。チオールの酸化感受性は酸化還元感受性の機能的スイッチとして機能し、ジスルフィド形成、及びその他の酸化物形成につながる、或いは有害な結果につながる。ここで、私はタンパク質チオール修飾の位置、動的変化及びその機能に対する我々の理解を大きく高めた、最近開発されたタンパク質チオール修飾のイメージ及びプロテオーム技術、並びに酸化的タンパク質チオール修飾に果たすミトコンドリアの中心的な役割を明らかにする研究の進歩について検証する。

はじめに

　システインは大抵の生物のタンパク質中、滅多に使用されることがない保存度の高いアミノ酸の一つである（1）。システインの遊離チオール基の反応性及びレドックス性はこれらの生物のタンパク質の構造、機能、及び制御にとって有益である。システインチオール基は求核性が高く、酸化還元反応、金属配位、及びチオール・ジスルフィド交換にとって最適であるが、活性酸素種（ROS）及び活性窒素種（RNS）による酸化に非常に弱い。

　ミトコンドリアの一番の役割はアデノシン三リン酸（ATP）の形で細胞の生体エネルギーを生産し、その供給を制御することであるが、同時に種々の細胞傷害に応答して、活性酸素種及び活性窒素種の産生に極めて重要な初期事象を内蔵し制御する。実際、ミトコンドリアのエネルギー代謝は、大多数の真核細胞の活性酸素種及び活性窒素種にもっとも量的に重要な機能であるとして認識されている。ミトコンドリアの活性酸素種及び活性窒素種は細胞機能、信号伝達、及び種々の病状の起因となる酸化ストレス、並びにニトロソ化ストレスと関係することが知られている。ここで、我々はタンパク質チオールの酸化修飾においてミトコンドリアが果たす中心的な役割を明らかにする最新のタンパク質チオール修飾のイメージング法及びプロテオミクス技法、並びにその分野の進歩を検証する。

タンパク質チオール修飾の多様性

　チオールはタンパク質の適切な酸化・還元状態の維持に主要な役割を担っている。チオールの酸化感受性はジスルフィド並びにより酸化性の高い生成物の形成につながる。全てのチオール修飾の中で、ジスルフィドが修飾されたチオール基のもっとも一般的な形であり、表面膜タンパク質、或いは分泌タンパク質の折り畳み、輸送及び機能にとって重要な構造要素であると主に考えられている（2-3）。この１０年、ますます多くのタンパク質がその活動を制御するために活性酸素種或いは活性窒素種を利用することが特定された（4）。タンパク質チオールの活性酸素種及び活性窒素種との反応がスルフェン酸、スルフィン酸、スルホン酸、並びにジスルフィド、グルタチオン化、及びS-ニトロソチオールと言った様々に異なった修飾形成につながる（5-7）。活性酸素種及び活性窒素種の毒性による酸化修飾は細胞のアポトーシス及び機能喪失を引き起こす（8）。しかし、準毒性の活性酸素種及び活性窒素種の生成から始まって、チオールはレドックス感受性スイッチ（9）として働き、遺伝子発現（10-11）、エネルギー代謝（7、12-14）、リン酸化反応（15-17）、タンパク質転移（18）並びに他の多数の事象（19-23）を含む活性酸素種及び活性窒素種を介した多様な細胞過程の要因となる。これらのタンパク質のシステイン残基は、酸化ストレス及びニトロソ化ストレスにさらされると素早くそして可逆的に修飾される。タンパク質のリン酸化 / 脱リン酸化と同じように、ほとんどの酸化的チオール修飾は素早く、未知の調節因子及び代謝フラックスにより可逆的な性質であることが示唆されている（6）。

タンパク質チオール修飾の検出とイメージング

　酸化的チオール修飾、ジスルフィド、S-ニトロソチオール、及び、特にスルフェン酸は最近、日増しに注意の的となり、より高度な検出方法が必要とされている。タンパク質チオール修飾の分析方法は、修飾過程の中で修飾信号の転移或いは喪失をさけるために、素早く、明確で、in situに効果的であることが理想的である。化学者たちはin vitroでのタンパク質のチオール修飾検出のために様々な方法を使用した。たとえば、全体的なS-ニトロソチオールのレベルは、先ず光分解開裂或いは化学反応によりS-ニトロソチオールを一酸化窒素に変換し、間接的に測定する。その後、一酸化窒素選択電極、化学発光分析法、或いは、オゾン、又は一酸化窒素検出用蛍光試薬（24-25）との反応生成物の蛍光発光により直接、電気化学的に検出する。チオールにより還元されると吸収スペクトルが変化するEdman試薬は、タンパク質の遊離チオール及びジスルフィド濃度の測定のために幅広く使用されてきた。質量分析技術（マススペクトロメトリー）はin vitroでタンパク質のチオール修飾を検出するための強力な方法であるが、技術的な難しさのために、生理的条件下でタンパク質のチオール修飾を検出する目的で質量分析技術が直接に使用されたという報告は数えるほどしかない（26-27）。

　これらのin vitro生化学的検出法は幅広く使用されてきたが、チオール修飾のプロテオームを研究するには、より正確なラベリング方法が必要とされる。in situでのこれらの修飾の検出及びイメージングは位置の特定並びに動的変化についての重要な情報を提供するが、in situのタンパク質チオール修飾状態を測定するには、生きている細胞内及びサンプル処理過程におけるチオールの酸化状態の複雑性、不安定性、及び可逆性と言った多くの難問がある。タンパク質S‐ニトロソ化、グルタチオン化、スルフェン酸形成（28-29）の免疫ブロット法及び免疫化学では修飾チオールに対していくつかの抗体が使用されてきたが、チオール修飾の不安定性、及び抗体の特異性の欠如により、その適用範囲は限られている。現在、チオール修飾のプロテオームの研究では、タンパク質チオール修飾を化学的に特異にラベリングする方法がもっとも成功している。一般的に遊離細胞内のタンパク質チオールはアルキル化試薬によりブロックされていることから、S-ニトロソチオール、スルフェン酸、及びジスルフィドを含む、標的のチオール修飾フォームから遊離チオールを産生するために特定の還元剤が使われた。そして、最後に、新しく産生されたチオール（22,30-33）を検出するために、種々の異なったチオール特異の蛍光プローブ或いは親和性プローブが使用された。タンパク質のスルフェン酸への酸化を測定するには、新しく合成された蛍光プローブ（34-37）を使ってタンパク質スルフェン酸を直接的にラベリングすることが可能である。グルタチオン化タンパク質は放射性のグルタチオン（38）により標識化できる。一旦標識化されたら、親和性プルダウン、1D或いは 2Dの電気泳動/ ブロッティング、及び質量分析（22,30-32,38-41）の組合せによりチオール修飾は分析可能となる。

　近年、チオール修飾に特異な標識方法が開発されたおかげで、研究者たちは細胞中のタンパク質チオール修飾を視覚化することができ、チオール修飾の全体的な位置、分布及び動的変化についての情報収集が可能となった。我々はin situで細胞内のS‐ニトロソタンパク質を素早くイメージングするための特異な方法を開発した。その方法では遊離チオールのアルキル化、次いでS-ニトロソチオールからの還元によりチオールを産生し、蛍光プローブのTexas redメタンチオスルホン酸誘導体で標識化する（32）。驚くことは、これらのS‐ニトロソタンパク質が主にミトコンドリア内、及びミトコンドリアの区画周囲に存在することをはっきりとイメージが示し、ミトコンドリアタンパク質が一酸化窒素の存在下で修飾され、又、機能的に制御される傾向があることを示唆している事実である。細胞内のタンパク質ジスルフィドのラベリングと同様の方法を使って、我々は哺乳動物細胞の中のタンパク質ジスルフィドプロテオームのイメージを取得した。イメージは、ゴルジ装置ではジスルフィド信号が強く、ミトコンドリアの中ではその信号が弱いことを示している（33）。これらの画像データは、通常の生育状態ではジスルフィドを含むほとんどのタンパク質は表面膜たんぱく質、或いは内分泌タンパク質であることを示すプロテオミクス解析と一致する。

ミトコンドリアはタンパク質チオール修飾で中心的な役割を担う

　ATP合成に必要とされる電気化学的なH+膜電位を構築するために継続的に酸素（O2）を還元するミトコンドリアにある電子伝達鎖には、恒常的な活性酸素種（42）の産生という大きな副作用がある。ミトコンドリアによって産生される本来の活性酸素種はスーパーオキサイド（O2-）であり、マトリックスMn-SOD、及びミトコンドリア中のCu/Zn-SOD（43-44）の活動を通して、より安定した膜透過性のH2O2に形質転換する。H2O2はその後細胞内に拡散し、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、及びチオレドキシンペルオキシダーゼ（45-46）と言った細胞質性抗酸化システムによって除去される。興味深いことには、軽度なアンカップリング経路の活性化の中で（47-48）、H2O2がミトコンドリアの活性酸素種産生の制御役をも務めることである。H2O2はまた、遊離基（フリーラジカル）のHO-（49）を産生する。反応性が高く、細胞の主要な高分子の全てを標的とするHO-は本質的にダメージ役（50）を担うと信じられている。ミトコンドリアは又、誘導型一酸化窒素シンターゼ２（51）の酵素活性を通じて生産される一酸化窒素（NO-）由来の活性窒素種の源の一つと考えられている。活性窒素種は一酸化窒素（NO-）と酸素（O2-）の反応で始まり、ペルオキシナイトライト（ONOO-）（52-53）を形成する。活性窒素種のもう一方の形である二酸化窒素（NO2）は炎症に重要な役割を果たしている可能性が高い（54）。呼吸鎖依存の亜硝酸還元酵素活性（55-57）を含む活性窒素種の代替エネルギー源は、ミトコンドリアの中に記述されている。ミトコンドリアでは活性酸素種及び活性窒素種のレベルは、酸化的損傷からミトコンドリア及び細胞自身を保護するため、効果的に管理・制御されている。ミトコンドリアの中にある一連の防御酵素（スーパーオキシドジスムターゼ－超酸化物不均化酵素、カタラーゼ、及びペルオキシダーゼ）が局部的な酸素濃度の制御に重要な役割を果たし、こうして活性酸素種及び活性窒素種のレベルを制御している。

　細胞の中のミトコンドリア及びその代謝作用による活性酸素種及び活性窒素種の生産はこれまで長期間研究されてきた。日ごとに増す文献の結果から、それらが関与する多数の病態生理学プロセスについてより多くの有益な情報が手に入るようになった。活性酸素種及び活性窒素種は多様な反応性試薬と接触すると、ミトコンドリアとサイトゾル間の通信を提供するシグナル伝達分子として機能する。このように、活性酸素種及び活性窒素種の生産は細胞内レドックスバランス（58）を維持する信号の一つであり得る。全体として、活性酸素種及び活性窒素種は単一エンティティとは捉えられず、その存在が産生の種、割合、数量、蓄積及び微小環境に依存する多様な化学種を包含する（59）。

　共焦点顕微鏡での観察及びin situのS-ニトロソチオール蛍光標識によって、我々はS‐ニトロソタンパク質が、主に静止細胞（32）における主要なスーパーオキサイド源であるミトコンドリアに存在することを発見した。本質的にミトコンドリアが欠如している細胞はS‐ニトロソタンパク質の形成が極端に少ない。細胞がスーパーオキサイド産生を減少させる電子伝達阻害剤で処理されると細胞内タンパク質S‐ニトロソ形成も又減少する。これらの研究はスーパーオキシドアニオンが内因性一酸化窒素、或いは外来性一酸化窒素と反応して、ニトロソ化種である ペルオキシナイトライト、或いはN2O3を形成することを示唆している。さらに、細胞とのS-トランスニトロソ化反応は一つのチオールから他のチオールへの一酸化窒素の再分布を容易にし、ミトコンドリアの 膜間腔（60）の低チオール酸化還元環境がSニトロソ化を進める遊離チオールの反応性を制限する

　チオールのジスルフィドへの酸化の主要源は最初、酸素による自発的な酸化だと考えられていた。グルタチオンは強力な中間体候補（61）であったが、ジスルフィド形成のために酵母にとって必要不可欠な遺伝子であるER貯留チオールオキシダーゼEro1（62）により酸化されていることが発見されたことにより、最近、ジスルフィド形成における役割が最小限なものであるとされた。哺乳動物細胞では、ERo1L或いはもう一つのタンパク質チオールオキシダーゼであるQsoxが細胞の製造に必要不可欠である、又はタンパク質チオールオキシダーゼのダウンレギュレーションが哺乳動物細胞でのジスルフィド形成に影響を及ぼすという事実はこれまでに示されていない。タンパク質ジスルフィドにも同様の蛍光標識方法を使って、我々はミトコンドリア由来の活性酸素種が、哺乳動物細胞における細胞表面タンパク質ジスルフィド形成を容易にするために活発に使用されること、並びにジスルフィド形成、ミトコンドリアの抑制、還元電位、及び細胞密度（33）の間に非常に強力な相互関係が存在することを発見した。これらの証拠により、これまでに理解されていた以上に、ジスルフィド結合のミトコンドリア酸化還元制御が広範囲であることが示された。ミトコンドリア呼吸及びミトコンドリア由来の活性酸素種産生の障害は、大きくタンパク質ジスルフィド形成を減少させ、細胞表面ジスルフィド含有受容体の亜群の機能障害を誘導した。この研究は他のいくつかの報告と共に、タンパク質ジスルフィドプールは構造的要素であるだけでなく、制御要素でありまた細胞の酸化還元センサーであることを示唆している。

展望

　ATP生産及び細胞の代謝制御という支配的な役割の他に、最近の多くの研究が示唆するようにミトコンドリアはタンパク質チオール修飾及び酸化還元信号においても重要な役割を果たしている。しかし未解決の疑問がたくさんある。例えば、ミトコンドリアによるタンパク質チオール修飾の制御の生理学的重要性は何か？　ミトコンドリア活性酸素種の標的タンパク質は何か？　どのようにミトコンドリアはチオール修飾レベルを感受し制御するのか？　現在ではタンパク質チオール修飾に特異な標識方法を使って、生物学的プロセスと疾患状態の細胞の酸化還元の帰結を探ることは可能であるが、これらの方法のほとんどには厄介な閉塞ステップと還元ステップが含まれている。我々は現在、タンパク質チオール修飾に必要な高感度に改善されたイメージ及びプロテオーム技術を開発中である。我々は、新しい技術の助けを借りてこれからの更なる研究により、タンパク質チオール修飾及び機能制御においてミトコンドリアが果たす中心的な役割を明らかにすることが可能であると信じている。