生体における蛍光分子イメージング研究の新たな進展

2010年10月22日

白浄：清華大学医学部生物医学工学科　教授、
博士課程院生指導教官

1956年生まれ
教育部「長江学者」特別招聘教授、IEEE Fellow、AIMBE Fellow
1985年　米Drexel大学で博士学位を取得
1981年　吉林大学で学士学位を取得
医学イメージング、生理システムのモデル構築、遠隔医療等の研究に従事。専門書5冊を出版、25件の特許を取得し、学術定期刊行物に300編余りの論文を発表。北京市優秀教学成果1等賞、129優秀青年教師1等賞、中国青年科学技術賞、国家教育委員会科学技術進歩2等賞、教育部門巾幗功績樹立尖兵、梅貽琦記念学術論文賞を受賞。また、国家傑出青年基金、国家自然科学優秀中青年特別基金、霍英東基金、国家教育委員会から第1期世紀を跨ぐ人材の称号、国家百千万プロジェクト第1期入選者、全国優秀科学技術者、教育部長江学者特別招聘教授、IEEE Fellow、AIMBE Fellow等の栄誉を得る。

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張永紅：清華大学医学部生物医学工学科 准教授

1969年生まれ
2004年　清華大学で生物医学工学博士の学位を取得
1994年　華中科技大学で生物医学工学修士の学位を取得
1991年　華中科技大学で生物医学工学学士の学位を取得

1. 序文

　結像原理の違いに基づき、分子映像技術は主として核種イメージング（PETとSPECT）、磁気共鳴イメージング（MRI）、光学イメージングに分かれる。他の分子イメージング法に比べ、光学分子イメージングはコストが低く、放射がなく、創傷又は毒性がなく、特異性が高く、多目標・多パラメータの検出が可能で、プローブの調製と保存に便利といったメリットを持ち、ますます多くの専門家・学者から注目されており、近年、急速な発展を遂げた。

　光学分子イメージングは主として生物発光イメージング（Bioluminescence imaging、BLI）と蛍光分子イメージング（Fluorescence molecular imaging、FMI）に分かれる。前者はルシフェラーゼ遺伝子を採用して細胞又はDNAを標識し、基質フルオレセインを注入した後、酸化反応を発生させ、蛍光を放出する。一方、後者は蛍光レポート基（例えば緑色蛍光蛋白質）又は蛍光染料を採用して標識を行い、外部から特定波長光源を照射し、励起によって蛍光光子を発生させる。上記の蛍光光子は生物組織内で散乱と吸収を経た後、生物体の表面に到達し、光学イメージング設備によって検出される。特定の再構成アルゴリズムを通じ、生物体内の細胞又は分子レベルの生理又は病理過程を反映した直観画像を再構成することができる。光子の透過距離に限りがあるため、光学分子イメージングは主に小動物の生体イメージング研究に応用されている。

　光学分子イメージングシステムは結像方式の違いにより、平面イメージングと断層イメージングの2種類に分かれる。平面イメージングは平面写真の原理に基づき、代表的な検出器を用い、光信号を集めた二次元図形を出力する。その原理は簡単で、使い勝手がよく、スピーディで、フラックスが高い等のメリットを持ち、このため、幅広く応用されている。しかし、平面イメージングで検出される信号は多くの深さから来る信号を重ね合わせたものであり、画像がぼやけ、分解能が低く、生物体内光源の深部情報を得ることができない。そのため、この方法は通常、薄い物体のイメージング又は表在イメージングに用いられるだけである。平面イメージングの限界を克服した新しい断層イメージング法は多点測定・収集を通じ、強散乱生物組織における光子の遷移法則と光伝播の数学モデルに基づき、特定の反転アルゴリズムを採用しており、光源の立体定位を行うことができ、当面の研究重点となっている。そのうち、蛍光分子トモグラフィー（Fluorescence Molecular Tomography、FMT）技術は低エネルギーの励起光源を用い、目標物の深部情報を再構成することができ、染料が安定し、コストが低く、長期の定量モニタリングが可能といった多くのメリットを備えており、非常に有望な新しいイメージング技術だと言える。

　国は蛍光分子イメージングを非常に重視しており、973計画、863計画及び国家自然科学基金で関連のプロジェクト研究をスタートさせた。中国科学院自動化研究所、清華大学など多くの研究機関が国の973計画の支援を受け、生体内蛍光分子イメージングの基礎理論と中核技術に対する研究を深めており、また、清華大学、中国科学院高エネルギー物理研究所等の機関は国の863計画の支援を受け、蛍光とPETの2つの方式による小動物イメージングシステムの共同研究を進めている。本論文では蛍光分子トモグラフィー技術研究の新たな進展状況を重点的に紹介する。

2. FMTイメージングシステム

　FMT始原型システムは主に励起光源、光学検出設備、小動物固定スタンド、制御装置、濾光板及び全く光を透さないイメージング暗箱から成る。励起光源は広域スペクトル光源（例えばハロゲンタングステン灯、キセノン灯）を採用し、これに特定波長の濾光板を加えるか、又は特定波長のレーザーを使用することができる。光学検出設備は当初、PMTを使用していたが、現在では高性能CCDカメラが採用されている。小動物は麻酔後にスタンドに固定され、イメージング暗箱の中に置き、制御装置でスタンドを制御し、水平運動、垂直運動又は回転運動を行う。光源が小動物の体表に照射され、CCDカメラを利用して、多くの角度と位置から小動物生体内の蛍光団に対し、投影イメージングを行う。集めた信号をコンピュータで処理すれば、生体内における蛍光光源の正確な位置情報を得ることができる。

　励起光源の違いに基づき、FMTシステムは主として連続波モデルと時間領域モデルの2種類がある。連続波モデルでは、定常強度の励起光が生物体に照射される。ここで検出するのは蛍光信号を励起した強度情報であり、蛍光プローブの三次元濃度分布が再構成される。連続波モデルのシステムは蛍光プローブ分布を比較的うまく局在化、定量化することができる。透過深さが大きく、信号雑音比が高く、感度が高く、設備が簡単で安定し、コストが低い等の特徴を備えているため、現在、FMTシステムはその大部分が連続波モデルのイメージングを採用している。

　時間領域モデルでは、超短パルス光で励起した蛍光信号が生物組織によって拡大された後、その時間曲線がゲート制御式検出器によって検出される。理論上、このシステムは最も多くの情報が得られ、蛍光寿命情報を再構成するだけでなく、早く到達する光子情報を利用してシステムの空間分解能を大幅に高めることができる。しかし、このシステムは実際の運用においてコストが高く、信号雑音比が低く、イメージング時間が長い等の制約を受け、その普及と応用にも限りがある。

　イメージングの構造から見ると、FMTシステムは接触式イメージングと非接触式イメージングの2種類に分けることができる。初期のFMTシステムは接触式イメージングであり、一般には円筒イメージングチャンバを採用していた。境界条件を簡略化するため、動物を整合液の中に浸し、光ファイバを通じてイメージングチャンバに接触させ、照射を行うとともに、境界の光強度分布を導出する。円筒イメージングチャンバを採用したFMTシステムは結像原理が簡単である。しかし、そのシステムは部品が多く、構造も複雑である。サンプリング数に限りがあるため、画像の再構成速度は速いものの、その品質と分解能は高くない。

　近年、FMTシステムの多くは非接触技術を全面的に採用し、又は検出器端においてこの技術を一部採用している。励起端では、点毎に走査した集束光点又は拡散した光面を通じて励起光源を提供し、一方、検出端では、高性能CCDを採用し、非接触信号の検出を行う。励起光源の走査は一般に二次元スキャナーを通じて実現されるため、光ファイバに照射する必要がなく、システムはより便利なものとなった。CCDの利用によって一層多くのサンプリングデータセットを得ることができるようになり、FMTの再構成画像の品質が高まり、再構成問題の不適切性が低下した。しかし、整合液と円筒イメージングチャンバを取り除いたため、FMT画像再構成の境界条件として、小動物体の三次元表面輪郭の情報を得る必要がある。

図1　非接触全角度蛍光分子トモグラフィーシステム

　図1は清華大学医学部分子映像研究チームが確立した非接触全角度蛍光分子トモグラフィーシステムである。小動物が支持物を通じ、昇降・回転可能な回転台の上に固定される。光源とCCDはそれぞれ動物に向き合う両側に位置する。回転台は小動物が等速で緩やかに回転するよう制御し、異なる角度から小動物の投影情報を得ることができ、これによって360°の全角度イメージングが実現される。研究チームは最適閾値に基づく小動物三次元輪郭再構成アルゴリズムを打ち出した。白色光から小動物の三次元輪郭画像を直接再構成することができる。このシステムは整合液及び組織に接触する光ファイバを使用しないため、実験装置と実験過程が大幅に簡略化され、高品質の投影データを集めることができ、また、散乱・蛍光断層計算方法を十分に利用することができる。その他、このシステムはスリットを入れずに他のイメージング方式と融合させることができ、FMTのイメージング性能が大幅に高まることが期待される。

3. 画像再構成アルゴリズム

　蛍光プローブが発する光エネルギーは微弱なため、また、生物組織の強散乱という特性から、生物組織内における光子の伝送経路は非常に複雑なものとなる。このため、生物組織内の光子の伝送法則を深く理解することは、FMTイメージングシステムの再構成アルゴリズムにとって極めて重要である。FMTのイメージング性能に影響する要因は主に2つある。それは適切な数学モデルを選択し、生物組織内における光の伝送を正確に記述すること（即ち順問題）及び、適切な画像再構成アルゴリズムを見つけ出すこと（即ち逆問題）である。

　光学イメージングの順問題研究は蛍光光源からの光子発射過程、生物組織内における光子の伝送過程及び、光子が検出器によって吸収される過程を含む。大部分の生物組織は高散乱、低吸収の媒質であり、生物組織の光子に対する作用には散乱、吸収等が含まれるため、生物組織内において光子は主に順方向の伝播となる。従って、通常は拡散方程式を採用し、強散乱性の生物組織内における光子の伝送を記述する数学モデルとしている。一般的な状況の下で、拡散方程式の解析解を得ることは難しく、通常は数値解法（有限差分法と有限要素法）又はランダム統計解法（Monte Carlo方法）を採用して解を求める。

　光学イメージングの逆問題は主に2つの種類に分かれる。1つは既知光源パラメータ、生物組織の幾何パラメータ及び検出器で得られる投影データであり、生物組織内部の光学特性パラメータ（例えば吸収係数、散乱係数等）の解を求めるもの。もう1つは既知生物組織の幾何パラメータ、光学特性パラメータ及び検出器で得られる投影データであり、一定の先験的知識を利用し、小動物体内の蛍光光源の正確な位置を定位する。

　現在、一般に採用されている再構成アルゴリズムは大体、摂動に基づく方法（Perturbation-based method）、傾斜に基づく方法（Gradient-based method）、有限要素法（Finite element method）等に分かれる。そのうち、摂動法は主にBorn近似法、Rytov近似法、Newton法を含み、生物組織の光学特性パラメータの再構成及び生物体内の蛍光光源の定位に既に幅広く応用されている。一方、傾斜法は解析する逆問題を非線形最適化の問題に転換し、1つの目標関数を構築するとともに、それを最小化させて最適解を得る。この研究は共役傾斜法（Method of conjugate gradients、CGD）、最速降下法（Method of steepest descent、SD）、代数再構成法（Algebraic reconstruction technique、ART）に関係している。有限要素法は複雑な幾何形状及び異方的に分布する媒質を効果的に処理することができ、且つ計算速度が速いため、光学イメージングの順問題と逆問題の解析に幅広く応用されている。

　清華大学医学部分子映像研究チームは光子伝送経路のMCシミュレーションと画像再構成アルゴリズムの研究面でたゆまぬ努力を払ってきた。例えば、順問題の研究では、表に基づくランダムサンプリング数値アルゴリズム（Table-Based Random Sampling Algorithm、TBRS）を打ち出し、計算が正確で、柔軟性があり、複雑な組織と光源に対する適応性が高いという伝統的なMC方法の特徴を保ち、計算時間を短縮した。

　現在、イメージングシステムのデータ量は増える一方であり、このため、イメージング速度を如何に高めるかという難しい問題に直面している。適応有限要素法と適応グリッド技術は徐々に細分化されるグリッド上での一連の反転を通じ、蛍光団が存在する関心エリアを細分化して、上記の問題を解決することができる。清華大学医学部分子映像研究チームは最小2乗共役傾斜法とLandweber方法を結び付けた適応有限要素再構成アルゴリズムを打ち出すとともに、これを実際のマウスの腹部輪郭モデルに応用し、良好な効果が得られた。また、平板イメージングに関し、同チームは解析解と適応グリッド技術に基づく高速再構成アルゴリズムを打ち出し、アルゴリズムに正確な解析解と高速技術を持たせると同時に、適応グリッド技術を利用してグリッドを効果的に分割し、再構成速度を一段と高め、画像品質を改善した。図2は単一蛍光体グリッドの選択性細分化過程及び再構成結果である。

図2　単一蛍光体の再構成

(a)初期グリッド分割　(b)第2次グリッド繰返し分割
(c)第3次グリッド分割　(d)単一蛍光体の再構成結果

　実際の小動物の光学パラメータは異質性が高いものであり、不均質な光線パラメータは光子伝播及びモデル構築に影響を与えることになろう。同研究チームはDOTに導かれるFMT再構成アルゴリズムを打ち出した。DOTとFMTの再構成はそれぞれ独立して行われる。その中で、DOT再構成問題は非線形最適化問題に転化され、傾斜に基づく最適化アルゴリズムを用いて解を求める。スピーディなDOT目標関数の共役傾斜計算法は非有限要素表面の節点における検出点まで拡大され、その応用範囲が一段と広がった。同時に、線形収束・発散後の処理段階がFMT再構成の中に加えられ、画像コントラストを変えない状況の下で、FMTの定量正確度が改善された。

　FMTを用いて小動物の全身の生理的変化過程を体内観察するため、研究チームは非接触全角度FMTシステムに的を絞り、線、面及び多点3種類の並列励起モデルを研究し、小動物の全身イメージングに用いる並列励起FMTシステムを確立した。システムは図1の点励起光源を線光源で代替しており、全身の変化の生物学的現象をスピーディに観察することができる。図3はヌードマウスの尾に0.15ml 13uMのICGを注射した後、異なる時間点と角度において観察したICGの全身分布であり、その代謝過程を反映している。図4はヌードマウスの体内における2つの蛍光団再構成効果の二次元、三次元表示である。

図3　ヌードマウスのICG代謝過程の生体全角度全身イメージング

(a)4cm線光源の照射の下における180°個所の蛍光図と白色光図の重ね合わせ
(b)0°、80°、180°、260°の個所及び、異なる時間点（1分間、2分間、48分間）におけるICGのヌードマウス体内での代謝分布イメージング効果図

図4　ヌードマウス体内における2つの蛍光団の全身生体イメージング

(a)4cm線光源の照射の下における180°個所の蛍光図と白色光図の重ね合わせ及び、蛍光団イメージング二次元図
(b)2つの蛍光団の三次元再構成効果、横断面の中の赤線はヌードマウスの輪郭を示している。

4. 応用と展望

　新たな分子、遺伝子発現の分析検出技術として、生体における蛍光分子イメージング技術は1.比較的高い時間分解能と空間分解能を備えている、2.腫瘍と良性組織の間で比較的高い軟部組織コントラストを有する、3.結像コントラストが生物分子と直接関係し、重要疾病の遺伝子発現及び生理過程の生体イメージングに適している、4.電磁放射がなく、染料が安定し、長期の動的モニタリングに適している、5.イメージングの結果が一定の定量性を備えている、等の特徴を持つ。そのため、この技術は腫瘍の成長と転移の生体モニタリング、遺伝子治療における遺伝子発現の生体モニタリング、有機体の生理的、病理的変化のプロセス解明、薬物のスクリーニング・評価といった前臨床研究に幅広く応用されている。

　生体における蛍光分子イメージングは臨床応用への大きな可能性を秘めているが、多くの面でなお挑戦（試練）に直面している。まず、特異性を持つ分子プローブと蛍光トレーサの標識技術を開発し、蛍光団と背景のコントラストを高め、生体光学イメージングの精度を高める必要がある。次に、現在の再構成アルゴリズムは再構成の精度、速度、感度、確度等の面で明らかに不十分な点があり、新たな再構成アルゴリズムを研究し、光源位置を正確に定位することは、この分野の研究における焦点及び難点の1つとなっている。その他、生体光学イメージングシステムの分解能はCT等の伝統的イメージングよりずっと低く、イメージングの新たなシステムと方法を研究する必要がある。

　多モード・イメージングシステムは2種類又はそれよりも多い各種イメージング技術の特徴を結び付けて、情報を互いに補い合うことができ、新たな研究分野及び発展動向となっている。国内の中国科学院自動化研究所と清華大学医学部は光学－CT2モード・イメージングシステムを確立し、解剖と分子映像の2種類の情報を提供する他、CTを利用して先験的知識を与え、光学イメージング性能と目標定位能力を一段と高めた。また、清華大学医学部と中国科学院高エネルギー物理研究所の共同研究による蛍光－PET2モード・イメージングシステムは1次走査を通じ、PET、FMT情報及び両者の融合情報を提供している。

　蛍光分子プローブ技術の発展とイメージング技術の進歩に伴い、蛍光分子イメージング技術は前臨床研究から臨床応用へと発展を遂げ、人類の医療に対して深い影響を及ぼすことが期待されている。