インフルエンザシュードタイプウイルス技術の応用研究の進展（その１）

2015年 6月24日

　インフルエンザは、インフルエンザウイルス（influenza virus）によって引き起こされる急性気道感染症である。インフルエンザウイルスは、一本鎖マイナス鎖RNAウイルスの一種であり、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）に属し、自然界に幅広く分布し、多くの禽類や哺乳動物に対して高度の感染性を持っている[1]。ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（nucleocapsid protein, NP）と基質タンパク質（matrix protein, MP）の違いに応じて、インフルエンザウイルスは、A型・B型・C型の3種類に分けられる。A型インフルエンザウイルスは抗原性に変異が発生しやすく、世界的な大流行を何度も引き起こし、大きな危害をもたらしてきた。インフルエンザウイルスはさらに、膜タンパク質のヘマグルチニン（hemagglutinin，HA）とノイラミニダーゼ（neuraminidase，NA）の抗原性に基づいてさらに異なるサブタイプ（HxNy）に分けられ、そのうちHAは1～17型、NAは1～10型まであり、理論的には170種の組み合わせが考えられる。2014年までに118種を超えるサブタイプのウイルスが、自然宿主である野生の鳥類から分離されている（H17N10サブタイプはコウモリの体内から分離された）[2]。そのうちヒトに感染するウイルスサブタイプにはH1N1とH2N2、H3N2、さらに突然変異した高病原性のH5N1、低病原性のH9N2及びH7のサブタイプの鳥インフルエンザウイルスがある[3-5]。B型インフルエンザウイルスの感染はこれまで、ヒトとアザラシでしか確認されておらず、その病原性は低い。C型インフルエンザウイルスが流行することは少なく、主にヒトとブタに感染し、一定の危害をもたらすことがある。感染性の強いインフルエンザウイルスは危害が大きいため、バイオセーフティレベル3（biosafety level 3，BSL-3）の実験室で研究と臨床診断をする必要があるとされるが、危険性を排除することはできない。そのため安全性の高いシュードタイプウイルス技術は、インフルエンザウイルスを研究する新たな方法として大きな発展の可能性を持っている。シュードタイプウイルスとは、そのエンベロープタンパク質が固有の遺伝子によってコーディングされておらず、ほかのウイルスの遺伝子によってコーディングされたウイルス粒子である。その細胞指向性と感染過程は真のウイルスと相似し、レポーター遺伝子を含んでおり、標的細胞内で単一周期の複製を行い、ウイルス粒子を再び組成することがないため、安全性・敏速性・感度・標準化などの面で高い技術的優勢を誇っている。本稿においては、ウイルスの作用メカニズムの研究や中和抗体・ウイルスタンパク質の機能の研究、薬物の研究開発、免疫学の研究などでのインフルエンザシュードタイプウイルス技術の応用を重点として紹介する。

1　インフルエンザシュードタイプウイルスの概要

1.1　インフルエンザシュードタイプウイルスの特性

　シュードタイプウイルスとは、レトロウイルスベクターAが別のウイルスBの外皮糖タンパク質を整合することでできる、Bウイルスの外来性ウイルスエンベロープを持つと同時にゲノムがAウイルスの特性を保持する組み換えウイルスである[6]。天然ウイルスとは異なり、シュードタイプウイルスの核酸分子上では、エンベロープタンパク質をコーディングする遺伝子が修飾されて感染性を失っており、ほかのウイルスの外膜タンパク質との整合を通じて感染過程を完了する。この種の組み換えウイルスは、ウイルスの自己複製能力を失っており、単一細胞周期の感染しかできないため、生物学的安全係数は比較的高い[6]。元のウイルスと比較すると、シュードタイプウイルスの宿主の適用範囲はさらに広く、トランスフェクション効率が高く、濃縮しやすく、血清補体の不活性化作用に抵抗でき、細胞周期に対する非依存性を持つ。病原性が高く体外で培養しにくいウイルスの研究にあたっては、シュードタイプウイルスの作成が、信頼性の高く有効で安全な方法の一つと言える。

　インフルエンザシュードタイプウイルス技術は、シュードタイプウイルス技術をインフルエンザウイルス研究の新技術に応用することを指し、目下、研究の焦点となっている。この技術の研究の核心は、インフルエンザウイルスの表面タンパク質のHAまたはNAの遺伝子と別のウイルスのコアタンパク質の遺伝子を、コトランスフェクションや共感染などの方式で、同一のウイルス粒子に発現させ、ヒトへの感染能力のないものとすることにある。インフルエンザシュードタイプウイルス技術は安全で信頼性が高いという特徴を持ち、インフルエンザウイルスとりわけ高病原性インフルエンザウイルスを研究する際の有効な代替方法となる。

1.2　インフルエンザシュードタイプウイルスの作成

　インフルエンザシュードタイプウイルスに関する最初の文献は1997年に見出される。Kretzschmarら[7]は、インフルエンザ外皮糖タンパク質のHAまたはNAを水胞性口炎ウイルス（vesicular stomatitis virus，VSV）に加え、HAまたはNAの偽型のVSV組み換えウイルスを作成した。HAとNAの浸透効率はVSV-Gタンパク質の25％から30％と約50％に達した。だが組み換えウイルス表面にはまだVSV-Gタンパク質が含まれ、レポーター遺伝子がないため、測定と定量は難しかった。近年では、レトロウイルスをベクターとして構築したインフルエンザウイルスHAシュードタイプウイルスがすでに発表されている。McKayら[8]は、H7サブタイプの高病原性鳥インフルエンザシュードタイプウイルスとM2発現プラスミドをコトランスフェクションし、組み換えウイルスの力価と元のウイルスの力価の比を10～30倍（レンチウイルスベクター）と5倍（レトロウイルスベクター）とすることに成功した。pNL4.3-R-E-ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus，HIV）のレンチウイルスベクターによるインフルエンザシュードタイプウイルスの構築もすでに研究されており[9]、このベクターにレポーター遺伝子を持たせることで、各種の測定や分析をさらに迅速に、簡便に行うことができる。研究の深まりに伴い、インフルエンザシュードタイプウイルスの製造方法は日増しに改善している。おおよその製造工程は以下の通りである。表面糖タンパク質の遺伝子とコアタンパク質の遺伝子、レポーター遺伝子のプラスミドを一定の割合でパッケージング細胞にコトランスフェクションする。プラスミドが完全に細胞に入った後、通常の培地に変え、必要であればプロテアーゼまたは外来性NAを加える。一定時間培養してから培地の上清を取り、0.45μmのろ過膜によるろ過によってシュードタイプウイルス粒子を含む細胞上清液を取得し、必要であれば遠心分離で濃縮し、-80℃で保存し、凍結・融解の繰り返しを避ける。

2　インフルエンザシュードタイプウイルス技術の応用

2.1　中和抗体の測定

　シュードタイプウイルス技術はHIVワクチンの研究に幅広く応用され、ウイルスの感染性を低下させると同時に、標準化可能で変異の小さい中和試験方法を実験室に提供している。この技術は同様に、ほかのウイルスの中和抗体の測定・研究に応用されており、狂犬病ウイルスやマールブルグウイルス、エボラウイルス、ハンタウイルス、ソウルウイルス、ニパウイルス、SARSウイルス、新型中東コロナウイルスなどの研究に用いられている[10]。インフルエンザウイルスの膜タンパク質はその中和抗原であり、インフルエンザシュードタイプウイルスはエンベロープウイルスの特性を持ち、整ったエンベロープ構造を持っている。さらにその膜タンパク質の生物学的活性はエンベロープウイルスに近い。そのことからインフルエンザシュードタイプウイルスは中和抗体測定に用いることができる。インフルエンザシュードタイプウイルスの中和抗体試験は、インフルエンザシュードタイプウイルスと様々な希釈度の血清とを適切な時間コインキュベーションした後、事前に用意した単層細胞または細胞浮遊液に加えて単感染させる。一定時間のインキュベーションの後、レポーター遺伝子の表現信号の減少を測定することによってシュードタイプウイルスの中和作用を評価する。最後に、用量反応の分析によって中和力価を得る。

2.1.1　H7N9とH5N1の中和抗体測定

　2013年3月に発生した新型鳥インフルエンザウイルスH7N9の大流行は、H7N9の危険性を人々に認識させた。Wallerströmら[11]は、H7とH5のシュードタイプウイルスを構築し、中和抗体測定を行った。実験の結果、シュードタイプウイルスによる中和抑制試験と伝統的なヘマグルチニン抑制試験（hemagglutination inhibition，HI）を比較すると、サンプル測定の感度と精度は一致した。これによってシュードタイプウイルスの中和試験が、実験周期の短さや評価指標の客観性、安全係数の高さなどの特長を持ち、H7N9ウイルスの活性を定量的に測定する方法として採用できることが証明された。伝統的なHIでは、ヘマグルチニンHA受容体と結合する抗体しか測定できなかったが、シュードタイプウイルス中和抑制試験ではさらに、NA受容体と結合する抗体も測定可能となる。抗体の測定範囲が広がったことで、個体の免疫応答産出のインフルエンザウイルスによる誘発の研究などに新たな方法が提供された。Molestiら[12]は、シュードタイプウイルス中和試験とHI試験の結果の関連性の研究を土台として、シュードタイプウイルスの保存条件についても研究した。この研究によると、シュードタイプウイルスは-20℃または-80℃の条件下で、さらには複数の凍結・融解を経ても、高度に安定した活性を保つ。このことは、インフルエンザシュードタイプウイルスの各実験室への普及と感染血清の現場における迅速な測定に便利なツールを提供した。Yangら[13]はさらに、中和抗体の測定へのインフルエンザシュードタイプウイルスの信頼性を証明し、シュードタイプウイルスとこれに対応する生ウイルスとでペア比較試験を行い、中和抗体試験や酵素結合免疫吸着試験、細胞変性試験、微量中和試験などを通じて、インフルエンザシュードタイプウイルスを用いた中和抗体測定が高い信頼性を備えていることを明らかにした。

2.1.2　交差性中和抗体の研究

　インフルエンザシュードタイプウイルスはさらに、各インフルエンザウイルス株間の交差性中和抗体の研究に応用することができる。免疫血清と様々なサブタイプのインフルエンザシュードタイプウイルスの免疫反応の状況を観察することによって、交差免疫が存在するかを判断することができる[14]。交差免疫が存在すれば、サブタイプの異なるインフルエンザウイルスに感染した人にも一種類のインフルエンザワクチンを応用できる、またはサブタイプの異なるインフルエンザウイルスに混合感染した人も一種のワクチンだけを接種すればいいということになり、インフルエンザウイルスの制御に重要な指導的意義を持っている。Qiuら[15]は、H1N1とH3N2、H5N1、H2N2のシュードタイプウイルス粒子を作成し、H1N1ワクチン免疫後のヒト血清で中和試験を行い、ワクチンが同源のH1N1のシュードタイプウイルスの中和抗体反応を促進できるだけでなく、H3N2とH5N1、H2N2のシュードタイプウイルスとの中和抗体反応も引き起こすことを明らかにした。体系からIgGを取り除くと、交差中和反応は完全に終わり、H1N1ワクチンに交差反応の中和エピトープが存在し、非同源ウイルスのIgG中和抗体反応を起こせることが証明された。多くのインフルエンザウイルス感染とワクチン接種を経て、インフルエンザウイルスに対するヒトの免疫の進化には理論的根拠が与えられている。

2.1.3　ワクチンの効力の評価

　シュードタイプウイルスは、ワクチン中和抗体試験のための簡単で特異性の強い方法であり、インフルエンザウイルス性ワクチンの研究に幅広く応用されている。Zhangら[16]は、構築されたH7N7とH7N9のインフルエンザシュードタイプウイルスを利用して、H7N7 DNAワクチンの免疫後のニュージーランド白ウサギの血清に対して抗体測定を行った。その結果、血清中に機能性抗体が存在することが確かめられ、H7N9インフルエンザウイルスワクチンの後続研究の実験の土台となった。

（その２へつづく）

参考文献：

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[16] Zhang L, Jia N, Li J, et al. Optimal designs of an HA-based DNA vaccine against H7 subtype influenza viruses[J]. Hum Vaccin Immunother, 2014, 10(7): 1949-1958.