中国遺伝子組み換えワタの研究開発・応用の20年（その３）

2016年12月27日

（その２よりつづき）

2 ワタの遺伝形質転換方法

　遺伝形質転換方法は、遺伝子機能の分析と作物形質の改良に必要な手段である。主要な植物遺伝形質転換技術は大きく二つに類別される。第一類は、直接遺伝子移転技術であり、遺伝子銃法やプロトプラスト法、リポソーム法、花粉管経路法、電気穿孔法、PEG媒介形質転換法などが含まれる。遺伝子銃形質転換法と花粉管経路法が代表と言える。第二類は、生物を媒介とした形質転換法で、主に、アグロバクテリウム媒介導入やウイルス媒介導入などの形質転換法があり、このうちアグロバクテリウムを媒介とした形質転換法は、操作が簡単で、コストが低く、形質転換率が高く、単子葉・双子葉植物の遺伝形質転換に幅広く応用できる。科学技術の絶え間ない発展に伴い、近年は、新たな形質転換技術が急速に発展している。例えば茎頂・シュート頂形質転換法、アグロバクテリウム菌液浸漬法、ナノベクター花粉媒介導入法などがある。これらの形質転換方法の発展と幅広い応用は、遺伝子組み換え育種に対して重要な意義を持っており、農作物の改良と新品種の選抜・育生の歩みを加速させている。

2.1 アグロバクテリウム媒介形質転換法

　アグロバクテリウム媒介導入法は、早期に応用され、実用的・効果的で、多くの成功例を誇る植物遺伝子組み換え方法の一つである。アグロバクテリウムは、土壤に存在する一種のグラム陰性菌である。現在、植物遺伝子組み換えの導入媒介に用いられているアグロバクテリウムは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスである。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、一種のTiプラスミドを含む。Tiプラスミド上にはDNA断片があり、T-DNAと呼ばれる。アグロバクテリウムが植物に感染すると、細菌は、植物の傷口を通じて、宿主の組織に進入する。だが細菌そのものが宿主植物の細胞に進入するのではなく、TiプラスミドのT-DNA断片だけが植物のゲノムに導入される。これが発現すると、根頭癌腫が引き起こされ、導入されたT-DNAは植物株の後代に形質転換され、通常、典型的なメンデルの遺伝の法則を示す。Tiプラスミドそのものは、約50kbのDNA外来遺伝子を挿入することができる。そのためこの形質転換ベクターを利用し、Tiプラスミド上の癌腫を引き起こす有害遺伝子を切除し、有益な外来遺伝子によって代替し、植物細胞に外来遺伝子を引き入れることはすでに、植物遺伝子工学研究における従来技術となっている。ワタアグロバクテリウムを媒介とした形質転換においては普通、リーフディスク法が用いられている。国外で早期にこの方法を利用したのはAgracetus社で、NPTIIとCATを「Coker 312」に導入し、遺伝子組み換え再生綿株を獲得した。国内で早期にこの方法を利用したのは山西省農業科学院綿花研究所生物技術研究室の陳志賢らで、除草剤遺伝子Tfdaを「晋綿7号」に導入し、遺伝子組み換え再生綿株を獲得した。現在は、中国農業科学院生物研究所や中国科学院遺伝・発育生物学研究所、中国科学院微生物研究所が、各地の農業科学院と協力し、アグロバクテリウム媒介導入法を利用して、オオタバコガとアブラムシに抵抗性を持つ1つ・2つ・3つの標的遺伝子をワタに導入し、シングル・ダブル・トリプル遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタの新品種を獲得している。

2.2 遺伝子銃射出形質転換法

　遺伝子銃は、1980年代初めにSanfordらが発明した。この技術の原理は、遺伝子銃の産出する高圧動力の衝撃波を利用して、外来DNAを包んだ重金属顆粒（タングステン粉や金粉など）を射出し、植物の細胞壁や細胞膜を貫通させ、植物細胞に入れるという原理である。外来DNAをランダムに植物細胞の染色体に統合し、外来DNA在を受容する植物の中での正常な発現と安定した遺伝という目的を達成する。10年余りの改良と向上を経て、遺伝子銃技術はすでに、タバコやイネ、小麦、ワタ、ダイズなど多くの農作物の品種改良への応用を成功している。この技術はさらに、一過性発現の研究や安定した遺伝子組み換え植物の育生の研究などに用いられている［64-67］。

2.3 花粉管経路媒介形質転換法

　1970年代末期、DNA断片ハイブリダイゼーション仮説理論と植物の開花・受精過程に対する解剖学・細胞学特徴の研究を土台として、中国人科学者の周光宇らは、外来DNAが花粉管の経過する珠心を通じて胚嚢に受精し、精卵融合細胞と早期接合子、早期胚細胞に形質転換するとの推測を立てた。その後、花粉管経路技術を構築し、この技術を通じて外来DNAを陸地綿に導入し、萎凋病に抵抗性を持つ新品種の育生に成功した。1993年、中国農業科学院生物技術研究所は江蘇農業科学院経済作物研究所と協力し、花粉管経路法を利用し、GFM Cry1A殺虫タンパク質遺伝子を中国で初めてワタに導入し、遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタ株を作り出した。花粉管経路法は、操作が簡単で、対象となる植物や外来DNAに対する特別の要求もなく、組織培養過程も要らず、形質転換速度が速く、育種周期が短いなどの長所を持っている。この方法はすでに、ワタやイネ、小麦、ダイズなどの農作物の改良や育種への応用を成功している［68-71］。

2.4 茎頂・シュート頂形質転換法

　伝統的なアグロバクテリウム媒介導入法は、幼胚と胚発生カルスが主要な受容体であり、受容体の遺伝子型が遺伝形質転換の成否を決定していた。カルスが形成する再生株は、ソマクローナル変異が大きく、周期が長いなどの短所があった。このため適切な外植片を選んでアグロバクテリウム形質転換の受容体とし、遺伝子型の制限を受けないスピーディーで効率的な遺伝形質転換体系を構築することが、遺伝子組み換えバイオテクノロジー研究者の目標となっている。茎頂培養は、植物組織の通常技術となり、すでに幅広く応用されている。幼胚は依然として、形質転換の受容体系統における重要な外植片となっている。成熟胚の茎頂の分裂組織から誘導された群生芽は、従来の幼胚と比べると、季節の制限を受けず、誘導率が高く、再生株の変異が少ないなどの長所がある。茎頂を改善する遺伝形質転換を通じて、アグロバクテリウム媒介導入法を利用して、ワタやトウモロコシなどの農作物の茎頂を形質転換し、転換周期を縮小し、陽性の遺伝子組み換え植物を得る方法を、茎頂/シュート頂形質転換法と呼ぶ。伝統的な幼胚とその胚発生カルスを受容体とした遺伝形質転換体系と比べると、この方法には、簡単、スピーディー、作業效率が高い、試験周期が短いなどの長所がある。また遺伝子銃法と比べると、より経済的で適用性が高い。さらに接合子形質転換と比べても、材料選びに季節の制限がないというメリットがある。だがこの方法には、獲得した遺伝子組み換え植物の後代にキメラが多く、ホモ接合の安定した遺伝子組み換え系統を得るのは困難であるとの欠点がある［72］。

2.5 アグロバクテリウム液浸漬法

　大多数の形質転換方法は、組織培養技術が必要となる。組織培養技術を通じて単細胞の選択を行い、完全な植物株を再生することは、キメラの出現を減少することとなるが、後生への影響と染色体の再配列によって体細胞にソマクローナル変異を引き起こし得る。アグロバクテリウム液を利用して植物組織（多くの研究では花器官が用いられる）を浸漬させて遺伝子組み換えを行う方法の特性は、組織培養と再生過程を回避することにある。先行研究によると、花器官の浸漬によって得られるT₀種子は典型的なヘテロ接合体であり、同一の挿入座には、2つの対立遺伝子のうちの1つだけがある［73-74］。大量の結果によると、形質転換の発生は花の発育の後期に起こる［75］。花の浸漬の方法は形質転換率が比較的高いが、形質転換する細胞と形質転換の時間はまだはっきりとわかっていない。

2.6 ナノベクター花粉媒介形質転換法

　20世紀末のナノサイエンスの発展に伴い、特殊な表面効果やスモールサイズ効果、量子サイズ効果、巨視的量子トンネル効果、良好な生物学的特性を持つナノ材料は、生物学の分野での応用に成功している。とりわけ効率的で標的のある遺伝子ベクター系統の構築には良好な媒介が提供された。1960年代末にジエチルアミノエチルデキストラン/DNA複合物による遺伝子伝達の媒介が可能であることが発見されると［76］、ナノ材料を遺伝子ベクターとする研究がいっそう深まっていった。

　ナノ遺伝子ベクターは、動物とヒトの細胞トランスフェクションテストでもすでに成功を収めており［77-78］、大きな応用の見通しを示している。ナノベクターは、植物の遺伝形質転換の面で、裸のDNA分子と比べると、形質導入率と遺伝子発現率が高い。日本大阪大学のTakefumiら［79］は、カルシウム塩粒子ミクロスフェアを遺伝子ベクターとして、プラスミドDNAをミクロスフェア内部に入れ、BY-2タバコ細胞のプロトプラストにトランスフェクションした。試験結果は、そのトランスフェクション率が、裸のDNA分子のトランスフェクション效率の10倍に達したことを示した。米国アイオワ州立大学のTorneyら［76］は、蜂の巣状メソポーラス二酸化ケイ素ナノ粒子をベクターとし、遺伝子とこの遺伝子の発現を刺激する化学物質を搭載し、金ナノ粒子でメソポーラスの表面をカバーした。このベクターは、植物の細胞壁を貫いて入ると、両者を植物細胞内に置き、適切な時間と場所で放出させ、遺伝子組み換え植物株の獲得に成功した。ナノベクター遺伝子によって技術改良した花粉管経路法の採用は、外来遺伝子の花粉管経路法における伝送を大幅に向上させ、伝送と形質導入の過程で外来遺伝子をDNA酵素による分解から守り、遺伝形質転換效率を高め、ワタなどの遺伝子組み換え作物新品種の育生により簡単で効率的な分子育種の新技術を提供することを可能とする。

　植物の遺伝形質転換におけるナノベクターの応用は始まってからまだ日が浅く、解决すべき多くの問題があるが、その他の植物遺伝子形質転換ベクターと比べると、ナノベクター技術は、生物との適合性が高く、安定性が高く、DNAの濃縮と保護の作用を持ち、搭載容量が大きく、表面性質が優良で、遺伝毒性と免疫原性がなく、製造が簡単であるといった長所を持っており、異なる材料や工法によってさまざまな「特異機能」を持ったベクターを製造できる。こうした材料は特に高価ではなく、ナノベクターの市場競争力はより一層高いと言える。このためナノベクターによる遺伝子組み換え技術は今後、植物遺伝子組み換え技術の有效な手段の一つとなると考えられる。

3 遺伝子組み換え植物の安全性評価

　優良な形質（害虫抵抗性、除草剤耐性など）を持つ一連の遺伝子組み換え作物新品種の大面積の普及・栽培は、直接的な経済・環境面での利益をもたらすと同時に、未来の世界の食糧やエネルギーの危機の解決に新たな道をもたらすものとなる。だが同時に、遺伝子組み換え技術には一定のリスクもある。近年、遺伝子組み換え生物の安全問題は、世界的に幅広い関心を呼んでいる。現在、遺伝子組み換え植物の安全性評価は主に、環境安全性と食品安全性の2つに集中している。

3.1 遺伝子組み換え植物の環境安全性

　遺伝子組み換え植物の環境安全性は主に、次の3つの面にかかわる。（1）遺伝子組み換え植物そのものが農地の雑草となる可能性。植物はある特定の遺伝子（耐病性、害虫抵抗性、除草剤耐性、ストレス耐性など）を獲得した後、その生存競争力を増強し、生長の勢いや越冬性、耐性、種子の生産量などの面で、非遺伝子組み換え植物を上回る。もし栽培が広がれば、自然環境中に放出される機会はとりわけ大きい。野生植物にはない各種の抵抗性を持つため、すばやく新たな優勢群となり、農地の雑草に変わる可能性がある［80］。（2）ほかの品種に対する遺伝子流動の影響。自然条件では、栽培作物と栽培作物の間、栽培作物と近縁の野生種の間、栽培作物と雑草の間で、品種間で遺伝子が流動する可能性がある。このため遺伝子組み換え植物の中の除草剤や殺虫剤、ウイルスの耐性遺伝子が、花粉雑交などのルートを通って同種または近縁野生種に移動し、除草剤や殺虫剤、ウイルスに耐性を持つスーパー雑草が産出され［81］、推測できない農業損失や環境面での災難を引き起こす可能性がある。（3）生物の多様性に対する影響。虫害や病害の抵抗性遺伝子を導入した植物はしばしば、比較的強い「選択優位」を持つようになる。大量の遺伝子組み換え植物が自然の生態系に入れば、元来の生息地の品種やほかの遺伝資源が淘汰され、品種の単一化が激化し、生物数の激減や元の品種の滅絶につながる可能性がある。例えばBT殺虫遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタは、オオタバコガやワタアカミムシガなどの植物の害虫をターゲットとしたものだが、害虫抵抗性ワタを広い面積で長期的に栽培すれば、昆虫は、害虫抵抗性ワタに対して適応性または抵抗性を持つようになる。これは害虫抵抗性ワタの応用とBT農薬製剤の防虫效果に影響を与え得る。このため害虫抵抗性ワタの普及においては一般的に、一定の比率での非害虫抵抗性ワタを栽培し、昆虫の抵抗性の産出を遅らせるという手段が取られる。（4）ターゲットでない生物に対して危害となる可能性。植物遺伝子工学において用いられる多くの遺伝子は、虫害や病害への抵抗性に関したもので、その直接作用する対象は生物である。昆虫または真菌に対して抵抗性を持つ遺伝子の導入は、ターゲットでない生物にも作用し、環境における有益な昆虫や真菌をも殺す可能性がある。米国コーネル大学のLoseyら［82］は、遺伝子組み換えBtトウモロコシの花粉が、ターゲット害虫ではないオオカバマダラ（Danaus plexippus L.）の幼虫の死亡をもたらすことを発見した。

3.2 遺伝子組み換え植物の食品安全性

　遺伝子組み換え食品または遺伝子操作食品（genetically modified food，GMF）とは、遺伝子組み換え生物を用いて製造または生産した食品である。遺伝子組み換え食品の安全評価を行う際には、食品の栄養成分に対する宿主やベクター、挿入遺伝子、組み換えDNA、遺伝子発現産出物の影響などの面から考慮する必要がある。評価内容には主に、次の4つの部分が含まれる。第一部分は基本的状況である。提供者と受容者となる生物の食用安全状況、形質や特性の遺伝子操作・導入・修飾につていの論述、実際に挿入または刪除される配列の資料、標的遺伝子とベクター構築のマッピングとその安全性、ベクターにおける挿入エリアの各断片の資料、遺伝子組み換え方法、挿入配列の発現の資料などが含まれる。第二部分は栄養学評価である。主要な栄養成分と抗栄養因子の分析が含まれる。第三部分は、毒性学評価である。急性毒性試験や亜慢性毒性試験などが含まれる。第四部分は、アレルギー性評価である。主に、国連食糧農業機関と世界保健機関が提出したアレルゲン評価決定木（Decision Tree）に従って評価し、既知のアレルゲンの導入を禁止する。

　中国農業科学院生物技術研究所は、江蘇省農業科学院経済作物研究所、山西省運城綿花研究所、石家庄市農業科学院、中国農業科学院綿花研究所などの多くの育種機関と協力し、自前の知的財産権を持つ耐虫性遺伝子植物発現ベクターを構築し、花粉管経路技術とアグロバクテリウム媒介導入法を用いて遺伝形質転換を行い、後代の分子鑑定と室内生物試験を経て、一連の遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタ品種を育て、今後の国内の遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタ品種の育生に特異的遺伝資源を提供すると同時に、国内の害虫抵抗性ワタの急速な発展に原動力を提供した。

　農業における遺伝子組み換え生物安全管理を強化し、人類の健康と動植物・微生物の安全を保障し、生態環境を保護し、農業遺伝子組み換え生物技術研究を促進するため、農業部は、多くの条例や弁法（規則）、公告を次々と打ち出し、遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタの農地への放出と産業化を規範化した。

　1996年に遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタ安全性評価の申請が開始されてから2013年までに、生産応用の安全性評価の申請通過件数は2016件に達した。図1からわかる通り、安全性評価の内容の充実や管理の規範化を受け、遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタの安全評価の申請プロセスを農業部が簡略化した2004年以降、安全証書獲得の件数は急激に上昇し、認可証書件数は毎年150件以上にのぼっている（図1）。

図1 2002—2013年遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタの生産応用安全証書獲得件数

Fig.1 The safety certificate of transgenic insect-resistant cotton with the production in 2002-2013

　中国が遺伝子知的財産権を持つ遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタの安全性評価は合計1955件にのぼり、このうちCry1Ab/cry1Ac組み換えワタは1391件で安全性評価総数2016件の69.00％を占め、Cry1Ab/cry1Ac+CpTI組み換えワタは553件で27.40％を占め、Cry1Ac+API組み換えワタは11件で0.55％を占めた。米国モンサント社のcry1Ac組み換え害虫抵抗性ワタ安全評価の申請・通過件数は61件で3.05％を占めた。

　総じて、1996年に国産害虫抵抗性ワタが農地試験に入り、各省のワタ育種関連機関による害虫抵抗性ワタ遺伝資源の利用が大規模化して以来、中国の害虫抵抗性ワタの研究と産業化は急速に発展し、国産害虫抵抗性ワタの作付面積は次第に増加していった。国産遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタの応用は、20年近くの苦難を経て、中国のワタ産業の発展と生態環境の改善に大きく貢献している。中国の遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタの安全性評価は、遺伝子組み換え害虫抵抗性ワタの生産応用の後ろ盾としての役割を果たした。

　現在、遺伝子組み換え作物の安全性評価技術と政策保障体系はすでに構築されており、今後はさらに、遺伝子組み換えワタの安全な生産応用の後ろ盾としての役割を拡大し、中国の遺伝子組み換え植物の分子育種高度技術を大きく発展し、高度技術の発展に有利となるポジションを早期に獲得し、中国の遺伝子組み換え植物の分子育種の国際競争力の向上に新たな貢献を果たす必要がある。

（その４へつづく）

※本稿は郭三堆； 王遠； 孫国清； 金石橋； 周燾； 孟志剛； 張鋭「中国転基因棉花研発応用二十年」（『中国農業科学』第48巻第17期，2015年、pp.3372-3387）を『中国農業科学』編集部の許可を得て日本語訳・転載したものである。記事提供：同方知網（北京）技術有限公司