核－細胞質輸送における蛋白質の発現制御と進化に関する研究の現状

2010年 5月12日

陶濤（Tao Tao）：
中国厦門大学生命科学学院細胞生物学教授、研究生院副院長

　1964年11月中国武漢市生まれ。厦門大学生命科学学院細胞生物学教授、厦門大学研究生院副院長。1986年武漢大学で学士の学位を取得、1989年に同大で修士の学位を取得。1991～1992年、大阪大学工学部生物工学学科（Biotechnology）で研修（UNESCOプロジェクト）。2000年、米Case Western Reserve Universityを卒業、哲学博士の学位（Ph.D.）を取得。2001～2003年、カナダのMcGill Universityでポスドク研究に従事。2004年～現在：厦門大学生命科学学院教授（Principal Investigator）。これまでに国家自然科学基金、科学技術部「863」、「973」プロジェクト、教育部博士授与スポット基金など10件余りの課題を手掛ける。中国プロテオーム学専門委員会委員、福建省微生物学会理事、米国細胞生物学会（ASCB）会員、World Journal of Biological Chemistry誌編集委員。

共著者：紀志梁、葉文鐸、林文波

　核－細胞質間における蛋白質と核酸の正確な分布は真核細胞の最も重要な生理的活動の1つであり、それはシグナル伝達、遺伝子の転写と制御、メッセンジャーRNAの分布、リボソームの組立及び分布等の生理過程の中でカギとなる制御作用を持つ（Tartakoff & Tao, 2010）。karyopherin β（importin β）ファミリー蛋白質は輸送受容体として、核－細胞質における高分子の移行シグナル（NLS/NES）を識別し、これらの高分子を細胞核又は細胞質に運び込む。このため、karyopherin βファミリー蛋白質はこの生理過程の中で非常に重要な作用を及ぼす。世界の多くの実験室は核蛋白質輸送の基本的過程と参加因子について系統的な研究を進めてきた。例えば、蛋白質における輸送・識別シグナル、輸送受容体、輸送受容体と基質の結合部位及びその構造の変化、RanGDP/GTPの制御、核孔複合体の構造及び機能等が報道されている。蛋白質の核－細胞質輸送に対する細胞の制御は基質の修飾、例えば燐酸化、アセチル化等で表すことができ、また、karyopherin αファミリー蛋白質の各発育過程に伴う制御で表すこともできる。しかし、karyopherin β蛋白質ファミリーの時空発現の変化については余り理解されていない。1998年～2000年、私は博士号を取得するため、米Case Western Reserve Universityに留学し、Huntington's diseaseを引き起こす蛋白質－huntinginが細胞核に集まる分子機序を主に研究した（Tao & Tartakoff, 2001）。また、2001～2003年にはカナダのMcGill大学でkaryopherin βファミリーの重要なメンバーであるimportin 13の生物学的機能を研究した（Tao et al., 2004; 2006）。その時、importin 13遺伝子の発現が発育過程の制御を受けることを発見し、karyopherin βファミリーのその他メンバーの発現も発育に制御されるのではないかと考えるようになった。このファミリーは140近くのメンバーが真核生物の中に分布しているが、ヒトには20の蛋白質しかない。このため、この140余りの遺伝子の細胞周期と生体発育における制御法則を系統的に研究することは、非常に困難な作業である。

　2004年、私は朱崇実厦門大学学長の招きに応じて中国に戻り、同大に自分の実験室を設けた。私はimportin 13の生理機能を研究対象に選び、karyopherin βファミリー蛋白質の発現制御パターンをどう効果的に研究するかを考えた。幸いなことに、現在の同僚である紀志梁教授も2004年にシンガポール国立大学から厦門大学にやって来て生物情報学実験室を設けた。たまたま言葉を交わす機会があり、その時、彼はヒトを含む多くの生物属種の遺伝子発現チップデータベースが既に公開されていると言った。私達はこのデータベースを分析すれば、karyopherin βファミリー遺伝子の発現制御パターンに関する情報を得られるのではないかと話し合った。しかし、これらのチップデータベースをどう分析するのか。紀志梁教授との話し合いの末、私達はネット上でこのデータベースを分析できるソフトをまず設計することを決めた。努力の末、私達は2006年にGEPSというチップデータベースオンライン分析ソフトを正式に発表した（http://bioinf.xmu.edu.cn/software/geps/geps.php）（Wang et al., 2006）。このソフトを応用し、私達はヒト、ネズミ及び酵母等の多種の生物を対象にkaryopherin βファミリー蛋白質をコードする遺伝子について分析を進めた。ヒトとネズミではkaryopherin βファミリー遺伝子の6種類の発現制御パターンをそれぞれ確定した。その結果、大多数のkaryopherin β遺伝子は発育の過程に伴い、発現量が増加したが、その後直ちに安定したものになった。RANBP6とXPO5の遺伝子は発育の中で、その発現レベルが上昇し、また、IPO9とRANBP17の遺伝子の発現にはほとんど変化がなかった。一方、IPO8遺伝子の発現は発育と共に急激に低下した。これらの発見はkaryopherin βファミリー蛋白質の発育に伴う機能の研究を深める上で土台となるものだ。同時に又、これらのデータはkaryopherin βファミリー蛋白質が発育の中で重要な生理作用を有することを示している。karyopherin βファミリーの遺伝子発現の調節機構を解析するため、私達はさらにMAPPERソフトを用い、ヒト、ネズミ、ニワトリ、ツメガエル、ゼブラダニオ、ミバエ、線虫、酵母の8種の生物を対象に、karyopherin β蛋白質をコードする全ての遺伝子の発現制御ゾーンについて分析を進め、多くの転写因子がこれらの遺伝子の発現制御に参加していることを発見した（表1）。これは遺伝子発現レベルにおいて、各種の生物がそれぞれ異なる制御パターンを使用している可能性のあることを示しており、それらは進化の面で必然的なつながりを持たない。

　表1：MAPPERが予測した8種の核－細胞質輸送受容体遺伝子において最も可能性の高い転写因子結合部位。

ヒト、マウス、ニワトリ、ツメガエル、ゼブラダニオ、ミバエ、線虫、酵母を含む。種の略語の後の数字はこの種内の核－細胞質輸送受容体遺伝子の数を表し、また、転写因子結合部位の後の数字はこの部位によって調節される核－細胞質輸送受容体遺伝子の数を表す（Quan et al., 2008）。

　karyopherin βファミリーメンバーは機能面で相似性を持つため、私達はさらにkaryopherin βファミリー蛋白質メンバーの進化関係について系統的な研究を行った。原核生物にはkaryopherin βファミリー蛋白質が存在しないが、真核単細胞生物の酵母にはkaryopherin βファミリー蛋白質をコードする遺伝子が14あり、線虫には10、ミバエには16、ゼブラダニオには23、ニワトリには17、ツメガエルには18、ネズミとヒトには各20の遺伝子があった。私達は直接保持、遺伝子複製（gene duplication）、レトロポジション（retroposition）の3つの機構を通じ、このファミリー遺伝子が酵母からヒトに進化し、そのうち8つの遺伝子は直接ヒトに進化したことを発見した。また、2つの遺伝子が進化の中で失われ、4つの遺伝子は遺伝子複製のパターンでヒトに進化していた（表2）。これらの発見はkaryopherin βファミリー蛋白質の構造と機能の研究を進める上で重要な手掛かりを与えるものだ（Quan et al., 2008）。

表2（ソース：Quan et al., 2008）

　Homeodomain-containingファミリー蛋白質は生体発育と細胞分化に影響する重要な転写因子であり、胚性幹細胞（ES細胞）の分化及び多くの器官の発育の中で決定的な作用を及ぼす。Arxはpaired-typed Homeodomainを持つ転写因子であり、神経細胞、膵腺細胞及び筋肉細胞の分化に直接参加し、脳、膵腺、睾丸等の組織の発育に大きな影響がある。しかし、Arxの機能が正常に発揮されるかどうかは、細胞核におけるその正確な局在と直接関係している。私達は研究の中でArxが2つの異なる核局在シグナル（NLS1とNLS2）を持つことを発見した。NLS1は主にkaryopherin αファミリーメンバーによって識別され、一方、NLS2は主にkaryopherin βファミリーメンバーによって識別される。Arx上のNLS2とそのHomeodomainはアミノ酸組成で重なっており、そのアミノ基末端とカルボキシル基末端にある塩基性アミノ酸から成る。構造面では既知の古典的な核輸入シグナルと異なり、NLS2が介在誘導するArxの核局在は主にimportin β1が介在誘導する非古典的経路で行われる。同時に又、他のkaryopherin β蛋白質、例えばimp9、imp13もArxを細胞核の中に局在化できることを発見した。私達はさらに各種のkaryopherin β蛋白質がそれぞれの機構を通じてNLS2を識別することを発見した。これは核局在におけるArxの経路が発育におけるArxの機能を制御する可能性のあることを物語っている（Lin et al., 2009）。Arx上のNLS1は主にkaryopherin α3、α5との相互作用により、古典的な核輸入経路を通じ、Arxを細胞核に導き入れる。この核輸入経路はArxの遺伝子転写制御機能に参加している。これはそれぞれの核局在経路が転写制御因子の生理機能に作用を及ぼすことを示すものだ（図３）。

図３：細胞分化又は器官発育の各時期に、転写因子Arxは転写後修飾により、
さらにはそれぞれの核局在経路を通じて細胞核に分布し、遺伝子発現を活性化し、細胞の分化を制御している。

　Nkx2.2は非paired-type Homeodomain-containing蛋白質であり、構造上は1つのアミノ基末端の転写抑制domain、1つのHomeodomain、1つのNK2ファミリーの特異なSD構造及び、1つのカルボキシル基末端の転写活性化domainを含む。Nkx2.2の機能はArxと似た点があり、神経細胞と膵腺細胞の分化及び関係組織の発育の中で重要な作用を有する。私達は細胞核におけるNkx2.2の局在もそのHomeodomain上のNLSが決定しているが、Homeodomain上のアミノ基末端とカルボキシル基末端にはそれぞれ完全な核輸入機能を持つNLSがあることを発見した。即ちそのHomeodomainには2つのNLSがあるのである。構造上、この2つのNLSは古典的NLSと似ているが、野生型Nkx2.2はkaryopherin αではなく、karyopherin βsと作用する。私達はNkx2.2の核局在がkaryopherin βsの非古典的核輸入経路で行われることを発見した（Lin et al., submitted, 2010）。

　私達は生体の発育に影響するHomeodomain-containingファミリー蛋白質がそのHomeodomain上のNLSを通じて細胞核に分布する分子機序を初めて解析し、同時に又、それぞれの核局在経路がその生物学的機能を制御しているとの仮説を初めて打ち出した。

　1990年代以降、中国経済の急速な発展に伴い、生命科学を含む科学技術に対する政府の資金投入が大幅に増えた。大学の中で「211」と「985」のプロジェクトを実施し、科学技術分野において「863」（国家ハイテク研究発展計画）、「973」（国家重点基礎研究発展計画」等のプロジェクトを確定することを通じ、外国に留学していた学者が大量に帰国し、中国の生命科学研究は飛躍的な発展を遂げた（Wells, 2007）。ゲノム学研究（Cyranoski, 2010）であれ、また、プロテオーム学研究（He & Liu, 2008）であれ、中国の研究陣は既に大きな勢力となっている。幹細胞生物学、腫瘍病因学、シグナル伝達、発育、進化等の生命科学の先端研究分野で顕著な成果が得られた。近年、中国の多くの研究チームが分子進化の分野で一連の素晴らしい探究を進めてきた。そのうち、張亜平研究チームは成熟した研究方法・体系を確立し、一連の遺伝子/蛋白質ファミリーの機能進化分析にこれを幅広く応用した。彼らは好血性（Hematophagy）と緊密な関係を持つトリプシン様セリンプロテアーゼ（Trypsin-like serine protease, Tryp_SPc）ファミリーを研究対象に選び、ミバエとカの中のTryp_SPcファミリーの数及びその食血前後における遺伝子発現レベルの変化状況を比較分析した（Wu et al., 2009）。その結果、カのファミリーの中に特異的増幅を起こすTryp_SPcサブファミリーが存在しており、そのメンバーは食血後に遺伝子発現レベルが著しく増大することがわかった。これとは逆に、特異的増幅のないTryp_SPcファミリーメンバーは食血後も顕著な遺伝子発現レベルの変化が見られなかった。カにおけるTryp_SPcファミリー遺伝子の増幅と分化は正の淘汰（positive selection）の結果であり、それらはゲノムの中に直列に並んでいる。また、その正の淘汰はプロテアーゼとその抑制剤が作用する表面部位で起きている可能性が高い。王文研究チームはミバエの新しい遺伝子の起源と進化に関する研究で大きな業績を上げた。この研究チームは全ゲノムスケールでミバエの新しい遺伝子の起源を明らかにするとともに、新遺伝子が発生する幾つかの可能なパターン及びその構造と機能の関連をまとめた（Zhou et al., 2008）。宿兵研究チームは東アジア人群の中で、冬の温度及び紫外線照射がp53の腫瘍抑制経路の遺伝的変更に影響を及ぼすことを発見した（Shi et al., 2009）。幾つかの器官の特異的な遺伝子又は蛋白質ファミリーを選び、機能進化の研究を進めれば、組織・器官の起源、分化及び生理機能をダイナミックに研究するための啓発的な手掛かりを得ることができる。張樹義研究チームは感覚器官系関連の遺伝子と蛋白質ファミリーを分子進化の対象に選んだ。例えば、哺乳動物の外耳細胞（OHCs）の中で聴覚系が高感度、高周波の信号を受信するのにカギとなる作用を及ぼすSLC26陰イオン－輸送蛋白質ファミリー（SLC26 anion-tranport family）のモーター蛋白質prestin（Liu et al., 2008, 2010）及び、波長に敏感なコウモリの錐体オプシン遺伝子（cone opsin gene）（Zhao et al., 2009）等である。反響定位（echolocating）種と非反響定位種の蛋白質prestinを比較することを通じ、彼らはprestinが辿ってきたダーウィンの選択による進化と正確な聴覚補正を特徴とする特殊な固定周波数の反響定位の進化が関連を持つことを発見した。夜行性哺乳動物（nocturnal mammals）－－コウモリの視覚関連遺伝子opsinファミリーの6,500年に及ぶ進化の過程を再構築する中で、張樹義研究チームは紫外線カラー視覚（UV color vision）が夜行性哺乳動物の感覚生態においてより重要な役割を演じていることを発見した。

　中国の科学者は遺伝子発現制御が細胞分化、器官発育、シグナル伝達、病気発生に及ぼす作用等の分野で多くの業績を上げた。具体例は次の通り。1．iPS細胞を利用して、細胞のゲノム再編成及び発育の潜在エネルギーを研究できることを証明した（Zhao et al., 2009）。2．エネルギー代謝を制御する蛋白質RIP3が細胞の衰亡又は壊死に調節作用を及ぼすことを発見した（Zhang et al., 2009）。3．蛋白質のアセチル化が細胞の代謝制御に作用を及ぼすことを発見した（Zhao et al., 2010）。4．PTB（ポリピリミジントラクト結合蛋白質）がpre-mRNAのそれぞれの位置に結合して、可変エクソンのスプライシングに対し、正負の両方向から制御を行うメカニズムを発見した（Xue et al., 2009）。5．β-arrestin-1がゼブラダニオの発育初期の造血器系に対し、カギとなる制御作用を及ぼすこと（Yue et al., 2009）、また、β-arrestin-2の機能がII型糖尿病と関係を持つこと（Luo et al., 2009）を発見した。6．神経膠星状細胞が小胞放出機構を備えることに関する研究を進めた（Zhang et al., 2007）。7．S.cerevisiae細胞の中で、ヒストンH3のアミノ基末端がDNAメチル化の制御に作用を及ぼすことを実証した（Hu et al., 2009）。

中国は既に顕著な成果を収めたが、開拓的な仕事は依然として少なく、蛋白質の発現と制御の研究分野で重大な影響を与える成果はまだ得られていない。科学研究体制の充実と多くのハイレベル研究陣の育成に伴い、中国は世界の生命科学研究により大きな貢献をするものと予測できる。