多能性幹細胞の樹立と応用

2010年12月 3日

周琪：
中国科学院動物研究所幹細胞・再生医学研究センター主任

　1970年4月生まれ。1996年、東北農業大学卒業、理学博士号取得。1999年から2002年まで、フランス国立農業研究センターにてポスドク及びプロジェクト責任者を務める。2001年、中国科学院「百人計画」に入選。これまでにすでにSCI収録論文45篇を発表。
主に体細胞リプログラミング・メカニズム、幹細胞・再生医学関連の研究業務に従事。現在、すでに多種のクローン動物モデルを確立し、世界でいちはやくマウスクローンの再現性を証明。初めて体細胞クローンラットを得、研究成果をScience、Development 、Developmental Biology等刊行物に発表。iPS細胞を利用して4倍体胞胚注射により、生きた繁殖能力のあるマウスを得、iPS細胞の万能性を初めて証明した。この成果は2009年にNature誌に発表され、また2009年度アメリカ『TIME』誌選出の年度医学10大ブレークスルー、中国科学院・中国工程院院士選出の2009年度中国10大科技進展、2009年度中国基礎研究10大ニュースに入った。

一、前書き

　多能性幹細胞は体外で永久的に自己更新することができ、同時に体内の任意の細胞を分化形成する能力を維持している。多能性幹細胞はこの特性によって、幹細胞研究、さらには幹細胞と交差するさまざまな学科の研究における焦点となっている。多能性幹細胞の早期分化過程における胚葉の選択と後期分化過程における特定の細胞譜への分化は、ある程度体内の発育・分化過程をシミュレートすることができ、それにより我々に早期胚胎発育及び細胞分化の分子メカニズムを研究する上でのプラットフォームを提供してくれているが、このことは研究材料の得にくいヒト胚胎及び個体の発育にとってとりわけ貴重である。さらに疾患由来の多能性幹細胞は、程度の差こそあれ、シャーレの中で疾患発生の過程をシミュレートすることができ、疾患発生のメカニズムの研究や、疾患に的をしぼった高処理能力の新薬スクリーニング、毒性テストに応用するのに便利である。多能性幹細胞及びそれが方向付ける分化の産物は、さらに細胞移植及び組織工学のために十分な量の細胞供給源を提供することができるため、再生医学の臨床応用のためにさまざまな可能性を提供している。多能性幹細胞の研究・応用の大きな将来性にかんがみ、我々は安定した多能性幹細胞、特に患者の特異な多能性幹細胞を樹立する必要がある。しかしながら、発育過程において、多能性は早期胚胎発育段階という狭い窓口にしか存在しないため、個体、特に成体から直接多能性幹細胞を得ることは非常に厄介である。1981年に初めてマウスES細胞（胚性幹細胞）が樹立されて以来30年間近く、多くの科学者は、それぞれの種からそれぞれ異なる方法で多能性幹細胞を樹立することを含め、多能性ES細胞の樹立に関する研究に力を尽くしてきた。それには主なものとして、早期胚胎から抽出を行って樹立したES細胞、単為生殖的に活性化された胚胎を用いて樹立したpES細胞（単為発生ES細胞）、核移植リプログラミングの方法を利用して樹立したntES細胞（核移植ES細胞）、特定因子を利用しリプログラミングを直接誘導して樹立したiPS細胞（人工多能性幹細胞）が含まれている。本論文は主にマウスとヒトの多能性幹細胞の樹立について紹介し、また中国の科学者のこの分野における進展について重点的に紹介するものである。

二、ES細胞

　1981年、EvansとKaufmanは初めてマウス胞胚から細胞を抽出してマウスES細胞を樹立した[1]。マウスES細胞は、マウス胚胎の発育と生物医学の研究において重要な役割を発揮したが、その中にはマウスES細胞を利用したノックアウトマウスの作製が含まれていた。1988年になって、James Thomson研究チームが初めてこの研究をヒトへと拡大し、ヒトのES細胞を樹立した[2]。ヒトES細胞は同様に、多種の細胞へと分化する能力をもっているため、再生医学研究において大きな応用の可能性を有している。これまで、中国の多くの研究室はマウスまたはヒトのES細胞を樹立することに成功している。これらの細胞を拠り所として、現在、中国科学院北方幹細胞バンク、上海幹細胞バンク、南方幹細胞バンクを含む、いくつかの比較的大きい細胞バンクが確立されている。これらのバンクには鑑定を経た大量のマウスとヒトのES細胞が保存され、研究者の使用に供されている。多くの研究室はこれらの細胞を利用して、心筋細胞、膵島細胞、神経細胞を含めた多種の細胞への分化方向付けを行っており、臨床細胞移植治療のための重要な基盤が築かれている。

三、ntES細胞

　ES細胞は早期胚胎からしか抽出できず、このことは患者の免疫互換的な多能性幹細胞を得るうえで困難をもたらしている。この移植技術は卵母細胞のリプログラミング能力を利用して、成体細胞核を脱核卵母細胞に移植し、再構築胚を構築するもので、再構築胚は胚胎の発育過程を継続して胞胚を形成することができ、また母体の子宮に移植して満期胎児へと発育させることができる。核移植した胞胚から抽出を行ってES細胞を樹立するという、生殖を目的としない技術は治療的クローニングとなる。治療的クローニングを利用すれば、患者の体細胞核を脱核卵母細胞に注入し、再構築胚の中から抽出を行って、患者と同じ遺伝物質をもったES細胞を樹立することができる。この種のES細胞の分化産物は、細胞移植治療を行うにあたって免疫拒否反応を起こすことがなく、したがって臨床応用において大きな優位性を具えている。核移植マウスのES細胞は2000年に初めて樹立された[3]。当研究室でも比較的早くマウスntES細胞を樹立した。ntES細胞とES細胞の違いを評価するため、さらにはその臨床応用におけるリスクを評価するために、我々は数十株のマウスES細胞とマウスntES細胞を樹立し、増殖能力、特定遺伝子の発現、体内外分化能力、全体的な遺伝子発現レベルなどの面で比較を行ったが、その結果はマウスntES細胞とES細胞にはこれらの面で違いがないということを示していた[4]。これは、治療的クローニングによって、ES細胞と同じ潜在能力をもったntES細胞を樹立することができることを物語っている。ヒトの治療的クローニングの方面でも、我々は多くの仕事をしてきた。核移植胚胎の発育効率によって、ヒト卵母細胞の形態学的ランク分けを行ったところ、ランクの高い卵母細胞に核移植を行ったときだけ、再構築胚胎の発育が比較的よかった。ヒトの治療的クローニング実験において、我々は安定的に胞胚を得ることができ、現在、その中から抽出を行ってES細胞を樹立しようと試みているところである[5]。治療的クローニングによってntES細胞を樹立し、関連の臨床応用を行うについては、二つのボトルネックがあるが、その一つは体細胞核移植効率が比較的低いことである。体細胞核移植効率を高めるために、我々は後成的修飾状態を変える可能性のあるいくつかの薬物小分子についてスクリーニングを行い、核移植に存在する体細胞リプログラミングの不完全さが改善できること、さらには体細胞核移植胞胚の得られる効率が高まることを期待した。その結果、CBHAはマウス核移植胚胎の胞胚率と樹立効率を著しく高めることができるということがわかった[6]。また我々は、核移植胚胎は培養の過程で、培養基の改変によっても胞胚発育率が著しく高められるということを発見した[7]。二つ目は、リプログラミング能力をもった卵の供給源をいかにして得るかということである。ヒト卵母細胞への依存を克服するために、研究者は二つの方面からこの技術を開拓してきた。まず初めは異種クローニングによる方法、すなわち、ブタ、ウシ、ウサギ等といったその他の種の卵母細胞を利用してヒト卵母細胞を代替し、体細胞のリプログラミングを行うものである。多くの研究は、その他の種の卵母細胞は確かに一定程度ヒト体細胞のリプログラミングを行うことができるが、再構築胚を胞胚にまで発育させる効率は依然として非常に低いということを実証している。中国上海の盛慧珍研究チームはかつて、ウサギ卵母細胞を用いてヒトの体細胞をリプログラミングし、そこから抽出を行ってES細胞を樹立することに成功したことを報告した[8]。その次の研究では、受精卵にもリプログラミング能力があり、マウス受精卵を利用して核移植再構築を行った再構築胚は、満期まで発育できるということを実証した[9]。我々の研究室は受精した二細胞胚胎を利用して受容体とし、二細胞胚胎を融合させて細胞核を取り除き、然る後にマウス体細胞に移植したところ、再構築した胚胎は胞胚段階にまで発育することができ、さらにその中からES細胞を抽出することに成功した（未発表）。この研究により、ヒトの治療的クローニングにおけるリプログラミング受容体の供給源を大きく開拓することができた。この結果が示しているように、未受精の卵母細胞のほか、臨床の体外受精実験の中で大量に廃棄される受精胚胎もまた、治療的クローニングの卵母細胞代替源として用いることができる。

四、pES細胞

　卵母細胞は受精作用によらずとも活性化され、胞胚段階にまで発育することができるが、この現象は単為生殖的活性化と呼ばれる。単為生殖的に活性化された胚胎は満期まで発育し続けることはできないが、内部細胞塊を含んでおり、そのためES細胞の樹立に用いることができる。pES細胞は正常な受精胚胎由来のES細胞と同じ特徴を有しており、体外では、三つの胚葉分化能力を具えた胚葉体を形成することができ、体内では、三つの胚葉分化能力を具えた奇形腫を形成することができる。pES細胞を卵割腔に注射し、移植すると、キメラマウスを作製することができる。受精胚胎または核移植胚胎由来のES細胞に比べて、pES細胞はキメラ動物において、大多数の組織のキメリズムが比較的低く、分化能力がやや劣っている。しかしながら、まさに単為生殖胚胎の発育障害のせいで、損なわれた単為生殖胚胎を通じて体外でpES細胞を樹立することは、ES細胞またはntES細胞を樹立することに比べると、倫理的障害が少なく、倫理面で社会から受け入れられやすい。2007年、ボストン小児病院等研究機関の研究者は、ドナーと同じ免疫原性をもったマウスpES細胞を初めて樹立したが、この幹細胞の分化産物は卵ドナーマウスに移植後、免疫拒否反応を引き起こすことがなかった[10]。これは、pES細胞は臨床移植面で免疫整合性のある細胞供給源とすることができるということを物語っている。より少ない倫理的障害、より高い安定した樹立効率のおかげで、少なくとも女性患者について言えば、単為生殖幹細胞はntES細胞よりもさらに免疫互換性のある多能性細胞供給源となっている。中国では、多くの研究者がこの研究分野で関連の研究を展開してきた。我々の研究室は大量のマウスpES細胞を樹立し、また2007年には中国で最初の例となるpES細胞を樹立した[11]。体外分化及び体内奇形腫の実験によって実証されたように、これらのpES細胞は体内・体外のいずれでも三つの胚葉分化能力を持ち、しかも一株のpES細胞は長期にわたる継代過程の中で、染色体が安定を保っている。これらの研究結果は、単為生殖幹細胞の普及と応用のために強力な証拠を提供した。湘雅医院の研究者も同時期にpES細胞の樹立に成功し、我々の結果と同時期に発表を行った。現在、中国の多くの研究室がpES細胞を利用して、神経系、膵島細胞、間葉細胞等への分化方向付けに関する研究を含む、さまざまな研究を行っているが、これらは将来の単為生殖幹細胞の臨床応用のために、有益な模索と基礎作りを行っている。

五、iPS細胞

　2006年、京都大学の山中伸弥博士は初めて、多能性幹細胞を樹立する一つの新しい方法を発表した。それは体細胞中に四つの転写因子Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4を過剰発現させると、体細胞を多能性幹細胞へと誘導転換できるというもので、このような多能性幹細胞はiPS細胞（人工多能性幹細胞）と呼ばれる[12]。iPS細胞は胚胎由来の多能性幹細胞に比べて、いかなる倫理的制限もなく、そのうえ方法面でも非常に簡単で、患者にとっては、自分に属する免疫拒否のない多能性幹細胞を気軽に「あつらえる」ことができるため、この方法はひとたび世に出るや世界の幹細胞研究の焦点となった。続いて、山中伸弥研究チームと米ウィスコンシン大学のJames Thomsonはさらに、ヒトiPS細胞の樹立に成功したことを同時に発表し、この方法が同様にヒト細胞に適していることを証明した[13,14]。iPS細胞はその人々を魅了する将来性により、中国の幹細胞分野でも焦点となっている。多くの中国の研究チームがiPS細胞の研究に力を入れるようになったが、これらの研究は主に以下のいくつかの問題を軸にしている。第一に、iPS細胞とES細胞は同じなのか？ 多くの研究は、iPS細胞が形態、遺伝子、たんぱく質発現、後成的修飾状態、細胞倍増能力、体内・体外分化能力などの面でいずれもES細胞と似ており、しかもマウスiPS細胞が種の合体したキメラマウスを形成できることを明らかにしているが、ただしこの二つが同じ発育潜在能力を具えているかどうかは、依然として疑問である。我々の研究チームは2008年に初めて、4倍体補償技術によりiPS細胞を用いてマウスを作製した[15]。4倍体補償技術は注射した多能性細胞を利用して、4倍体胚胎に欠けている発育能力を補償するもので、最終的に生まれて来る動物は全部の細胞が4倍体胚胎に注射した多能性細胞から来ているため、細胞の多能性を判定する最高の基準となっている。完全にiPS細胞から来ているマウスは、iPS細胞がES細胞と同じ発育能力を具えていることを初めて実証した。4倍体補償によって生まれた最初のiPS細胞マウスは「タイニー」と命名された。「タイニー」の登場は同時に、以前の核移植技術とは異なる一つの動物無性生殖方式、すなわちiPS細胞と4倍体補償技術によってクローン動物を作る方式を提示したが、これは動物生殖と農業分子育種の面で重要な将来性を有しているため、英ロスリン研究所のハリー・グリフィン所長はこれについて「'タイニー'は'ドリー'（世界初のクローン羊）の点火した松明を引き継いだ」と論評した。この研究は同じ時期に、北京生命科学研究所の研究チームとアメリカの研究チームによっても報告された[16,17]。この研究のあとに続き、我々の研究チームも一群のmicroRNA、すなわちDlk1-Dio3領域を選別し、この領域がiPS細胞の多能性決定において重要な役割を果たしていることを実証した。Dlk1-Dio3領域が開いているiPS細胞は4倍体補償技術を通じてマウスを作り出すことができるが、Dlk1-Dio3領域の閉じているものはそれができない。第二に、iPS細胞の誘導メカニズムはどのようなものか？ 4つの転写因子によるだけで、iPS細胞をうまく得ることができるという、その内在的メカニズムはどのようなものなのか？ この問題は細胞運命決定の研究に対し重要な示唆を与えている。中国広州健康研究院の研究チームとアメリカの研究チームは、一つの可能性のある誘導始動メカニズム、すなわち細胞運命の「内胚葉から外胚葉への転換」について同時に報告したが、このメカニズムはiPS細胞の産生と癌の発生には、ある程度の関連性が存在している可能性があることを予告している[18]。中国科学院生物化学細胞生物学研究所のある研究チームは、4個のYamanaka転写因子のゲノム結合部位について分析を行い、その結果、iPS細胞の多能性の維持についてある程度解明を行った[19]。第三に、いかにしてiPS細胞樹立の方法学上の障害を解決するのか？ iPS細胞の樹立には、ゲノムに挿入された外因性因子、誘導効率の低下などの障害が伴っている。北京大学の研究チームは、p53経路を制御するとiPS細胞の品質と効率が高められることを初めて発見した[20]。中国広州健康研究院の研究チームは、Vitamin Cが誘導効率を大幅に高めることができることを発見し[21]、我々の研究室は成分のよりはっきりしているKnockout Serum Replacement（KOSR）がiPS細胞の誘導効率を高めることができることを発見した[22]。第四に、iPS細胞はけっきょく何ができるのか？ iPS細胞は生物医学における多くの応用、たとえば薬物スクリーニング、農業分子育種、組織工学、再生医療等のために、新たな可能性を提供している。多くの中国の研究チームはこれらをめぐって研究を展開してきた。たとえば、北京大学のある研究チームはサルiPS細胞を初めて樹立し[23]、同研究チームはさらに上海のある研究チームとともにラットiPS細胞を初めて樹立した[24,25]。同時に、多くの研究チームはさらにiPS細胞を利用して、分化方向付けについての研究を展開し、疾患iPS細胞を利用して体外疾患シミュレーション研究を展開している。これらの研究は多能性幹細胞の応用に対しきわめて大きな推進作用を有している。

六、結語

　多能性幹細胞は自身のもっている体内の任意の細胞に分化するという潜在能力と同じように、発生生物学、細胞生物学、生物医学、薬物開発など、多くの基礎研究、臨床治療、転化応用のために無限の可能性を提供してきた。30年近くにわたり、多能性幹細胞の樹立方法と関連の応用について、研究者らは多くの研究と模索を繰り広げ、この分野と関連分野に対する人々の認識を大いに深めてきた。今後、中国の科学者と世界の科学者は引き続きこの分野のために、持続的なより大きな貢献を果たしていくに違いない。