中国インフルエンザウイルス診断技術の最新動向

舒躍龍 高栄保 （中国疾病予防制御センター･ウィルス研究所 国家インフルエンザ研究センター） 2009年2月12日

舒躍龍（Shu Yuelong）：

1970年3月生まれ。中国疾病予防・制御センター　ウイルス予防・制御研究所副所長、国家インフルエンザセンター主任、アジアインフルエンザ委員会委員兼衛生部インフルエンザ防止治療専門委員会委員。 1998年中国予防医学科学院病原生物学博士学位取得、同年、9月Mount Sina Medical School,とUniversity of California, Los Angeles留学。2002年2月ウイルス研究所着任。主な研究はインフルエンザ/鳥インフルエンザウイルス分子ウイルス学および病理メカニズム、新型ワクチンと検査方法。国内外学術誌に学術論文の発表、中英文50編以上、そのうちSCI関連は11編、十あまりの項目の国内外研究課題を分担。1998年国家科学技術進歩二等賞獲得、1999年衛生部科学技術進歩一等賞獲得、2007年中華予防医学会科学技術二等賞獲得。

　急性の呼吸器感染症のインフルエンザは未だに完全な制圧方法が見つかっていない。周期的に世界的に大流行している。20世紀、インフルエンザは３回大流行した。1918年のH1N1亜型、1957年のH2N2亜型、1968年のH3N2亜型である。研究発表によると1957年以来ほとんどのインフルエンザウイルスの変異はどれも中国で発生している。なぜ中国で発生するのか？その原因は未だはっきりしない。しかしこのため、中国はインフルエンザの多発地域であるとされている。したがって、中国のインフルエンザの状況は世界保健機構や世界各国から注目を浴びている。中国でもインフルエンザについて多方面から研究を行っており、血清学診断技術やウイルス抗原検査分析技術、現在広く採用されている分子の診断技術など、新たにいろいろな検査診断技術を採用してきた。技術の絶え間ない進歩により、従来の方法に存在している問題点を克服し、不足していたところを補ってきた。新旧の方法を駆使して、ずいぶんインフルエンザの予防研究は進んできた。これまでのところ、鳥インフルエンザの診断および予防対策などの面で成果を挙げてきており、とくにインフルエンザウイルスの分子診断技術では著しい成果を挙げてきた。本稿では中国のインフルエンザウイルス分子診断技術の最新の発展状況を概観し、これがインフルエンザの予防対策および検査技術の向上に役立つことを期待する。

一、 インフルエンザウイルスの生物学的特性の概略

　検査技術の発展と応用は多くが病原体構造を基礎にしており、ここでまず、インフルエンザウイルスの生物学的特性を紹介したい。インフルエンザウイルスはオルトミクソ・ウイルス科に属し、3タイプある。甲（Ａ）乙（Ｂ）丙（Ｃ）型インフルエンザウイルスである。その中でＡ型インフルエンザウイルスはその表面が糖タンパク質ヘムアグルチニン（HA）ノイラミニダーゼ(NA)の高変異特性、抗原性変異によるものでこの2種類のタンパク質抗原性の差異でＡ型インフルエンザウイルスや異なる亜型に分かれる。今までにHA亜型16種類（Ｈ１～Ｈ１６）、ＮＡ亜型9種（Ｎ１～Ｎ９）。が発見されている。人混みでは主にＡＢ型インフルエンザウイルス感染を主とする。Ａ型インフルエンザウイルスは定期的に流行り、Ｂ型インフルエンザは限られた地域で突発的な発生を引き起こす。インフルエンザウイルスは断片的なＲＮＡウイルスであり、全部で7つの構造タンパク質と１つの非構造タンパク質（ＮＳ）から構成されている。構造タンパク質は核タンパク質（ＮＰ）と基质たんぱく質MとHA、NA、PA、PB1、PB2である。前の四種はウイルス粒子の構造遺伝子であり、後ろの三種はウイルスの逆転写や複製にかかわる機能性ポリメラーゼである。これらはウイルス粒子の中での分子量は大きいが量的にはごくわずかである。ＮＳタンパク質はウイルスに感染した細胞中に存在するが、ウイルス中からは見つからない。具体的機能はまだはっきりしておらず、現在の研究課題である。

二、インフルエンザウイルスの検査技術の概略

　亜型インフルエンザウイルスの種類が多い上に遺伝子の突然変異、置き換えおよび組み替えを頻繁に行う。そのためウイルスの変異は早く、その病原性も千差万別である。とくに高病原性の鳥インフルエンザＨ５Ｎ１は種を越えて世界の多くの国に感染が広がった。以来、インフルエンザウイルスの早期診断と血清学観測がインフルエンザの予防、制圧の前提条件となっている。インフルエンザウイルスの検査技術では、現在は病原検査と血清学検査の両方が主である。病原検査で最も採用されているのがウイルス隔離と早急な診断技術（金コロイドとDot ELISA技術）、分子診断技術である。ウィルス隔離はウイルス特性の分析に欠くことのできない材料を提供し、早急な診断技術はすばやい早期診断に確かな実験根拠を提供する。高い感度と特異性によって分子診断技術は高い信頼を得ている。近年、中国国家ウイルスセンター（ＣＮＩＣ）は抗体検査技術において、インフルエンザ/鳥インフルエンザの一元放射溶血（ＳＲＨ）、微量中和実験（ＭＮ），凝血抑制実験（ＨＩ）、間接酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）とウェスタンブロッティング（Western blot）等の血清学診断技術をあいついで確立した。これらの技術の採用は中国インフルエンザ/鳥インフルエンザの早期診断と早期予測警報システムの構築に寄与している。

三、中国のインフルエンザウイルス診断技術の最近の状況

　近年、生物学研究技術の発展により、分子生物学技術はインフルエンザ/鳥インフルエンザウイルスのすばやい診断に多く用いられている。2003年中国大陸で人に感染する鳥インフルエンザの爆発的な流行を引き起こして以来、インフルエンザ/鳥インフルエンザウイルスのRT-PCRやReal-time RT-PCR、RNA 特異的な定温核酸増幅法（Nucleic acid sequence based amplification, NASBA）、分子識別診断法（molecular differential diagnosis, MDD）、マイクロアレイ等の診断技術が中国で迅速に発展し、採用されてきた。

（一）RT-PCRとReal-time　RT-PCR技術

　近年発達しているのがRT-PCR法で、遺伝子レベルでインフルエンザウイルスのRNA遺伝子を検出することができる。この方法は高い感度と特異性を持ち、インフルエンザウイルスの検出時間をかなり短縮でき、従来のインフルエンザ診断技術のウイルス分離鑑定試験周期が長いという欠点を克服した。これはインフルエンザ/鳥インフルエンザの早期診断に敏速かつ、実用的な検査方法を提供した。これ以外にも核酸標識法や検測技術の向上に伴い、蛍光標識技術がPCR技術に採用されている。これによって定量PCR技術を確立した。この技術はリアルタイムの観測と検査感度の向上を実現したと同時に、核酸が検査で環境を汚染するのも避けられる。また交差汚染による偽の陽性結果を示す確率を大幅に減少した。インフルエンザウイルスの各々の遺伝子発現の差により、異なる遺伝子のPCR増幅の感度にも差が生じる。通常、NPの検査はHAとNA亜型で敏度が高い。また、M1遺伝型も同様に特異性を持っている、進化率は他の内在タンパク質遺伝型より低い。有機体の免疫抵抗力を受けにくく、突然変異は主に自然突然変異の影響を受けているため[1]、種別の鑑定に広く用いられている。現在、我が国の国家インフルエンザセンターはインフルエンザウイルスのMとNP型遺伝子の保守区域に対する特異的なプライマーとプローブを設計し、直接臨床病例の標本によるインフルエンザウイルスのタイプ鑑定のRT-PCR とReal-time RT-PCR検査技術を確立した。その他に、インフルエンザ/鳥インフルエンザのHAとNA遺伝子の準保守区域にも、プライマーとプローブを設計し、Ａ型インフルエンザウイルスの各亜型鑑定のRT-PCR とReal-time とRT-PCR検査技術を確立した。H5N1ウイルスに対してその検査感度はそれぞれ1TCID50と0.1TCID50である[2]。RT-PCR とReal-time RT-PCR技術はインフルエンザで特に人に感染する鳥インフルエンザ病例の早期診断では、ほかの方法には代替できない威力を発揮している。 　PCR技術が成熟していくにつれてMultiplex RT-PCRとNested RT-PCRはインフルエンザウイルスの検査を大いに発展させた。2004年我が国のH5、H7、H9亜型Multiplex RT-PCR試剤キットの研究開発に成功し、世界で初めて一度に三種類の鳥インフルエンザ亜型を検査できるようになった[3]。謝芝勛等[4]が打ち出したMultiplex RT-PCRでは鳥インフルエンザウイルスRNAとH5、H7亜型RNAの最低検出量はそれぞれ10と100、100pgである。Multiplex RT-PCRとNested RT-PCRを結合させてNested Multiplex RT-PCRを打ち出し、更に感度を高めた。わずか0.01～0.1TCID50[5] のウイルス量でも検出が可能である。

（二）NASBA技術

　RNA塩基増幅法（Nucleic acid sequence-base amplification,NASBA）は持続恒温核酸増幅法である。現在中国では主に鳥インフルエンザウイルスの検査鑑定に採用されている。この方法の高速反応はAMV逆転写酵素と、ファージT7 のRNAポリメラーゼ、RNase H、2種類特別設計の オリゴヌクレオチドプライマーの共同作業で完成される。上流5'末端のプライマーがファージT7のDNA依存するＲＮＡポリメラーゼのプロモータ塩基配列を含む。下流5'末端はルテニウム電気化学発光プローブと相補の塩基配列を含む。増幅反応中に2つの5'末端は増幅塩基配列に結合するので、高い効率で増幅すると同時に、相補RNAの鋳型になるとともに、検査ステップのECLプローブの標的の遺伝子と特異的な結合もできる。増幅反応後、産物の一部を混合溶液（捕獲用のオリゴヌクレオチドを中和する磁性粒子とECLオリゴヌクレオチドプローブを含む）に加える。温育後、互いに結合した増幅後の残存物とECLプローブは複合物を形成し、この複合物の磁性粒子は電極表面の磁性によって捕獲され、電極の電圧は電気化学発光反応を引き起こし、すでに結合しているルテニウム磁性粒子が発する光と増幅したRNA産物の総量は比例する。劉楽庭等[6]はM遺伝子とH5、H7亜型遺伝子HAに基づいて、すでに鳥インフルエンザ H1-H15 、NASBA-AIV、H5亜型（NASBA-H5）、H7亜型（NASBA-H7）の特異性を検出できるNASBA/ECL検査キットの開発に成功している。商品化された免疫検査試剤キットよりも感度が1000倍以上にもなった。現在、分子標識プローブ（Molecular beacon）がNASBA技術に取り込まれ、Molecular beaconを従来技術体系のルテニウム電気化学発光検査に替えることによって、蛍光信号を測定することでリアルタイム検査の目的を達成した。この方法では操作手順の簡略化と同時に検査時間も短縮できる[7]。そのほかにNASBA増幅の産物はRNAなので核酸産物が環境に対する汚染を減少することができる。中国ではNASBA技術はすでに鳥インフルエンザウイルスH5N1感染の臨床診断に採用されている。

（三）分子鑑別診断技術

　分子鑑別診断技術（Molecular Differential Diagnosis, MDD）は標的塩基配列高度多重分子PCR（Target enriched multiplex PCR，Tem-PCR）とMultiple Analysis Profiling（xMAP）との融合した溶液チップである。この技術は一度の反応で同時に多種の標的遺伝子を検出できるので、一回の検査で多種のウイルスの診断につながる。呼吸器感染は発生しやすくよくある疾病の一つで、症状は似ており長期の臨床データにより、呼吸器感染の大部分はウイルス感染によるものと証明されている。これらのウイルスにはよくあるインフルエンザウイルス以外にもRSウイルス、アデノウイルス、メタ肺炎ウイルス等多くのウイルスがある。よくある呼吸器ウイルス検出技術MDDの開発および樹立は、少量サンプル、多重検査、かつ高速大量スクリーニングの検査を実現し、呼吸器感染病原体の確認にすばやいスクリーニング方法を提供した。現在、中国国家インフルエンザセンターはこの検査技術を評価[9]し採用している。インフルエンザの病例と原因不明の肺炎病例の呼吸器標本に対して検査を行い、インフルエンザウイルス感染の確認にデータを提供している。これ以外にＡ型インフルエンザウイルスの亜型の多い特徴に対し、国家インフルエンザセンターはインフルエンザウイルスMDD検査技術を樹立した。Ａ型、Ｂ型、H1N1、H3N2、H5N1、H9N2、H7N7インフルエンザウイルスを同時に一回で検査でき、人に感染する鳥インフルエンザウイルスの病例サンプルの検査では、その感度と特異性はそれぞれ93.3%と100%である[9]。

（四）マイクロアレイ技術

　マイクロアレイは同時に数千以上のヌクレオチド配列をスキャンでき、診断方法としては大きな潜在能力を持っている。インフルエンザウイルスの特徴は変異が絶え間なく起り、マイクロアレイを利用すると、同じ遺伝型ウイルスの異なった株の交配結果は異なり、亜型確定の根拠になる。[10,11]。賈菲等が打ち出したインフルエンザ/鳥インフルエンザ検出およびその毒性の鑑定用マイクロアレイ[12]は一度にＡ型、Ｂ型、H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等のインフルエンザウイルスを鑑定できる。同時にHAの切れる位置に基づいて、特異的なプローブを設定することによって毒性の識別もできる。遺伝子チップ技術は素早い一回の検査で多種のウイルスの検出ができる利点があるが、現在中国で病原体の検査と診断についてはまだ実験段階であるが、これはその感度、重複利用性や操作の利便性等に関係すると思われる。

（五）分子病理診断技術

　分子病理診断は伝染病、とくに新種伝染病の感染機構の究明と予防対策にとって重要である。現在、インフルエンザウイルスに対する分子病理診断技術には主にIn situ・ハイブリダイゼーションと免疫沈降法、および両者結合した染色技術がある。これらの技術はH5N1に感染した死体の病理解剖標本に採用され、H5N1ウイルスに感染した組織の分布と可能な伝播経路の証拠を示すと同時に、H5N1ウイルスの感染機構の究明に技術的手段を提供した。顧江等[13]がIn situ・ハイブリダイゼーションなどの病理診断技術を用いて二例の鳥インフルエンザウイルスH5N1に感染した死体を解剖検査した結果では、鳥インフルエンザウイルスが呼吸器系組織以外の多組織器官にも感染することを発見した。中国国家インフルエンザセンターは中国国内から得た人に感染する鳥インフルエンザウイルス20余りの株、のNPとHAの相対的な保守区域に対し、オリゴヌクレオチドDNAプローブを設計し、オリゴヌクレオチドプローブを用いる　In situ・ハイブリダイゼーションを確立した。この技術も中国鳥インフルエンザ感染死亡病例診断に採用されている。

（六）その他分子診断技術の発展

　上述のような発展し、成熟した分子診断技術以外に、インフルエンザ/鳥インフルエンザの分子診断技術はわが国でも絶え間なく発展している。その中には免疫技術と結合したPCR ELISA技術[14]や、RT-LAMP法およびPCR-RELP法[16]等がある。これら技術の実用にはさらに検証や評価が必要である。

三、結び

　ウイルス感染の疾病、とくに新種突発性伝染病の発見はある程度の絶え間なく発展する診断技術にかかっている。インフルエンザはよくある病気であり多発する。インフルエンザウイルスの発見には長い歴史があり、インフルエンザウイルスの診断技術は歴史的に大いなる蓄積がある。現在、インフルエンザウイルスの検査は大きく分けて二つある。季節性インフルエンザウイルス感染と鳥インフルエンザウイルス感染である。前者は主にウイルス分離および血清学鑑定を応用したもので、ウイルスに対し分子生物学技術を使ってウイルス遺伝子の特性の分析を行っている。鳥インフルエンザウイルス感染の検査診断では分子診断技術は重要な役割を果たしている。インフルエンザ/鳥インフルエンザ分子診断技術の発展及び応用では、季節性インフルエンザウイルスの検出に用いられている即効性の多分子診断技術の研究開発が今後有効であろうと考えている。それは臨床治療の方向を示すと同時に疾病監視における施策の根拠にもなる。今後、高病原性の鳥インフルエンザウイルスの診断に敏感かつ特異的な分子診断技術の発展が必要であり、同時に高速診断技術の普及もしなければならない。