中枢神経再生材料の研究の状況

2011年12月28日

崔 福齋 （Cui Fuzhai）：
清華大学材料科学工程系再生医学・生体材料研究所所長、教授

1945年11月生まれ。1984年、清華大学卒業（材料科学専攻、工学博士）。1986-1988年、オランダFOM研究所でポスドク研究。1989-1990年、清華大学材料系副教授。1990年～、清華大学材料系教授。1998年～、清華大学材料研究院生物材料研究室、主席専門家。2008年～現在、清華大学材料系再生医学材料研究所所長。Biomaterials、Tissue Engineering、JBMR等のSCI刊行物で学術論文250本以上を発表。2007-2008年、米国医学生物工学会（AIMBE）及び国際バイオマテリアル学会連合（IUS-BSE）フェロー。2008年、国家技術発明二等賞の第一受賞者。

共著者：王　頴、于　曉龍

1 はじめに

　脳及び脊髄、すなわち中枢神経系の（CNS）再生の問題は、神経科学及び医学の理論研究及び臨床実践において長きにわたり困難を極め、今なお効果的な解決方法の見つからない難題である。CNS再生の問題には、神経細胞（主にニューロン）の細胞体及び樹状突起の新生だけでなく、関連する周辺環境及び神経機能の回復も含まれる。CNSは損傷後の再生能力がないため、外傷によるCNSの損傷は特に深刻で、この例としては脳皮質機能の損傷または消失、脊髄麻痺等がある。高等脊椎動物の成熟期におけるCNS損傷後の再生阻害の原因としては、次のいくつかが推測できる。すなわち、ニューロンそのものの再生能力に限りがあること、神経栄養因子の生成が足りないこと、軸索再生に対する抑制因子の存在、ならびに局部グリア細胞の損傷により堅固な瘢痕が形成され軸索の成長・貫通が阻害されることである。

　CNSの再生はきわめて複雑な病理学・生理学的プロセスであり、ニューロンそのものや関連する微小環境等の面にまで影響する。神経の再生を促す方法としては、現時点では主に外的抑制因子の除去及び内的再生能力の促進という2つの大きな道筋が存在する。CNS中の髄鞘は神経の再生を抑制する主な障害であり、NogoRの発見がCNSミエリン中のさまざまな軸索の成長抑制たんぱく質に作用を及ぼす焦点となるため、Nogoと関連する遺伝子及び薬物治療がCNS損傷後の軸索の再生及び修復を促進する新たな有効手段となるだろう。神経栄養因子の応用は、CNSの再生能力を強化する重要な手段となっている。これら因子には主に神経成長因子（NGF）、脳由来神経成長因子（BDNF）、神経栄養因子3（NT一3）、神経栄養因子4／5（NT一4／5）等がある。研究によれば、生体用足場材料は神経再生の面できわめて積極的な役割を果たす。その役割とは、すなわち、神経グリア細胞における瘢痕形成の抑制、血管・軸索伸長に対するブリッジの提供、成長因子としての細胞キャリアの代替等である。大脳及び脊髄の組織構造は末梢神経（PNS）の組織構造に比べてはるかに複雑であるため、再生医療における修復研究は始まったばかりである。軸索の成長促進に適した環境を形成するために、CNSの再生促進に関する研究ではすでにさまざまな材料が応用されている。

2 中枢神経再生材料

2.1 脳の再生材料

　外傷により脳が損傷されると、脳組織には一連の生化学反応や分子反応、炎症反応が生じ、続発性組織損傷及び細胞死がもたらされ、最終的にはグリア瘢痕で覆われたキャビティが生じる。外傷による脳の損傷以外に、手術による損傷組織または腫瘍の除去によっても脳にはキャビティが形成され得る。CNSに再生能力が欠落しているのは、おそらく損傷部位の複雑な細胞及び分子環境によるもので、さらには再生抑制因子の存在と同時に脳実質の欠乏するキャビティ内では細胞は接着しようがなく、成長円錐も成長のすべがないためである。脳のキャビティ内に足場材料を移植すると、次の効果が得られる。すなわち、支持的マトリックスを提供し、細胞及び軸索の成長を誘導し、軸索の再生促進因子及び細胞のキャリアとなり得る等である。

　ハイドロゲルは親水性ポリマーで形成される、水に溶けない高度に架橋されたシステムであり、高い水分含有量と組織の類似した力学性能を持つため、軟組織の修復に非常に適している。膨潤型ハイドロゲル内部の水分は、ゲル内のイオン及び代謝産物を外部の間質液と交換させることで組織の化学的環境のバランスを維持する。ハイドロゲルの多孔質構造により、細胞は骨格内部に接着し、伸長しうる。また、ハイドロゲルには成長を促す細胞外マトリックスを修飾し、またはポリペプチドに接着する潜在能力があるうえ、損傷部位に生物活性分子を輸送できることから、細胞の接着と組織の成長を促進することができる。このため、ハイドロゲル材料は非常に将来性のあるCNS足場材料であり、さまざまなハイドロゲル、例えば、ポリ-N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリレート（pHPMA）、ポリヒドロキシエチルタクリレート（pHEMA）、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロン酸等が脳の損傷修復に用いられている。

　ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの主なタンパク多糖成分であり、人体に広く分布している。ヒアルロン酸は線形アニオンポリマーであり、すべての2糖単位が一分子のグルクロン酸と一分子のN-2-アセチルグルコサミンで構成され、2糖単位間はグリコシド結合で結合され、鎖状の分子構造[β-Dグルクロン酸-Nアセチルグルコサミン]nを構成している。ヒアルロン酸は医療の応用面で多くの利点がある。ヒアルロン酸の重複する2糖単位はすべての種及び組織と一致するため、ヒアルロン酸分子そのものに免疫的排除が生じることはない。ヒアルロン酸のポリアニオン、大分子量及び直線形で枝分かれ構造を取らない等の物理化学的特性により、ヒアルロン酸溶液は高い粘弾性を持ち、人体のすべてのシステムにヒアルロン酸代謝の効率的なルートが存在する。

　再生医療における足場材料の研究開発手法の一つには、天然の細胞外マトリックスの基本成分及び構造のシミュレーションがある。ヒアルロン酸は早くから脳の細胞外マトリックスの主な成分の一つとして見出され、かつ、CNSの形成及び成長プロセスにおいても非常に重要な役割を果たしてきた。Rauchは、ヒアルロン酸をベースにした脳の細胞外マトリックスモデルを提示した。このモデルでは、脳組織の細胞外マトリックスはヒアルロン酸とさまざまなネクチンとの結合により形成された三次元骨格により構成されると考える（図1のとおり）。しかし、純ヒアルロン酸材料はニューロンの接着と成長に向かないため、CNS修復の足場材料に適さない。このため、この研究グループはポリリジンをタンパクに接着してヒアルロン酸を改質し、ヒアルロン酸の神経細胞との接着性及び相溶性を強化した。そして、このヒアルロン酸基ハイドロゲルを成人ラットの損傷された大脳皮質に移植した結果、神経細胞と良好な相溶性を有し、グリア瘢痕の形成を抑制でき、かつ、神経グリア細胞の材料への遷移・移行を誘導でき、軸索再生に良好な生体内微小環境を提供し、改質後のハイドロゲルへの神経軸索の伸長を促進することが分かった。また、この材料は脳修復時の血管再生を促進する機能もあることがわかった。

図1 ヒアルロン酸をベースにした脳の細胞外マトリックスのモデル

2.2 脊髄再生材料

　脊髄は損傷されると、損傷部位付近で細胞死が生じる。細胞死には、ニューロン、グリア細胞及び内皮細胞、ニューロン及び軸索の退化による機能性損傷及び麻痺等が含まれる。脊髄損傷後の続発性損傷には、炎症反応、ワーラー（Wallerian）変性及びグリア瘢痕の形成等がある。グリア瘢痕は主に反応性グリア細胞及び侵入性脳膜の線維芽細胞により構成される。これら2種類の細胞はさまざまな再生抑制因子を表現し、これにはCSPGsが含まれる。このほか、脊髄の損傷部位には髄鞘破片に由来する再生抑制因子が存在し、これには例えばNogoや、ミエリンと関連するタンパク多糖が含まれる。グリア瘢痕には、軸索及び組織の修復を抑制する細胞及び分子学的微小環境が存在する。現時点では、脊髄損傷の効果的治療法は存在しない。全身にメチルプレドニゾロンを使用するような臨床治療方法では脊髄の損傷を軽減し、機能回復を改善できるが、免疫抑制反応や胃腸の出血、筋ジストロフィー等の副作用がある。脊髄損傷を治療する薬剤を全身に使用した場合によく見られる問題としては、血管-脊髄障壁を通過させにくいことと、タンパク分解の治療で効果が失われること等がある。損傷部位に局部的に治療薬物を使うことでこれら問題は克服できる。このほか、損傷部位に生体用足場材料を移植することで、局部的に薬物を放出できるうえ、軸索の接着及び成長を物理的にバックアップできる。

　ハイドロゲルも、脊髄修復に広く応用される足場材料であり、脊髄の再生促進において理想的な特徴としては以下の点がある。すなわち、①生物相溶性。体内組織に対する刺激性が比較的低いこと。②細胞の遷移及び軸索の成長を促すこと。③生分解性または生体内吸収性。薬物放出が終わった後または組織再生後に移植物質を取り出す必要がないこと。④一部のハイドロゲルはin situでゲル化または直接注射することができ、任意の形状のキャビティを充填できること。in situにおけるゲル化は、温度変化、イオンの架橋、光による励起で実現できる。コラーゲン、メチルセルロース、アガロースはよく利用される、温度に敏感な生分解性ポリマーである。コラーゲン、メチルセルロース、アガロース、アルギン酸、ポリエチレングリコール基（PEG）ハイドロゲルは、げっ歯類の脊髄損傷の修復にすでに広く使用されており、軸索再生を促進するための骨格として利用されている。

　脊髄内の軸索は一定方向に配列されているため、平行で縦方向に配列された微小管またはマイクロフィラメント構造を持つ材料も脊髄損傷の修復に関する研究で応用されており、再生された神経線維に一定方向の通路をあらかじめ設定するのに用いられる。例えば、Khanらは横断状の脊髄損傷部位に炭素フィラメントを移植した結果、軸索はその上部またはその間で再生して伸長することが見出され、炭素フィラメントの表面には良好な接着性及び脊髄の軸索再生に対する顕著なバックアップ効果があることが証明された。

3 生物材料による神経幹細胞の複合に関する研究

　近年の研究では、成人のCNS内に存在する神経幹細胞及び特定の分化方向を持つ前駆細胞には、潜在的かつ非常に大きな修復機能があることが見出されており、成人の中枢神経系では細胞の再建は不可能であるというこれまでの観念がくつがえされた。神経幹細胞の神経系疾患の治療に新たな道筋を開拓するもので、国内外の神経科学分野における研究の関心事である。現在、神経幹細胞を体内に移植し、CNSの再生・修復を促進する研究はすでに数多くなされている。神経幹細胞には、例えばハンチントン病、多発性硬化症、パーキンソン症候群、中風及び脊髄の疾患・損傷等、脳の失調・疾患・損傷を治療する上での潜在能力がある。

　とは言え、神経幹細胞は移植された後、損傷または患部の炎症及び組織の低酸素状態のために、きわめて少数の幹細胞または分化後の細胞しか生き残れない。ところが、生体用足場材料及び神経幹細胞を組み合わせて使用することにより細胞の微小環境を比較的良好に制御できることから、移植後の生存率を引き上げられる可能性がある。このため、幹細胞技術の発展、特に神経幹細胞の発見及び応用に伴い、生体用足場材料と神経幹細胞をいかに効果的に結び付けるかが重要になってきている。より良いCNS修復效果を得ることが現在のCNS再生医療における関心事となっている。

　関連のin vivo研究のいずれもが、生体用足場材料は神経幹細胞の移植の面で非常に重要な役割を果たすことを示している。移植された神経幹細胞は一部の面で損傷部位の回復を促進でき、体内でさまざまな数のグリア細胞及びニューロンへと分化するうえ、宿主のニューロン及びグリア細胞は足場材料中に統合され得る。細胞移植の際に生体用足場材料を使用するか否かで効果は異なり、全体的に見て細胞と足場材料を結び付けて採用した際の結果が最も良く、これら結果の改善は、材料によって創造される化学的微小環境や位相構造と関係するものと考えられる。まず、例えば中風や外傷によりCNSが損傷された後に損傷部位でキャビティが形成された場合、人工材料は被移植者の神経幹細胞に簡単な力学的バックアップを提供する。次に、材料の修飾を通じて活性成分を負荷することにより環境因子に対する制御を実現し、神経幹細胞又は他のタイプの細胞に栄養面での支援を提供する。体外の単独な可溶性因子は神経幹細胞を敏感に制御でき、そのうちの大部分をある種の細胞タイプに分化させる。生物材料上でこれら因子を複合することで、神経幹細胞に対する誘導・分化を実現できる。また、生物材料にとってみれば、適切な機械的・幾何学的性質により、損傷部位へのニューロンの接着が促進される。脊髄内の軸索の成長は方向が定まっているため、この手法は脊髄損傷にとって非常に重要である。例えば、Prangらは成人の脊髄中の神経幹細胞を平行な繊維を有するアルギン酸ゲル内に接種して脊髄損傷部位に移植した結果、神経幹細胞は生物材料の軸方向に向かって配列された。

　幹細胞周囲の基質は幹細胞の微小環境における重要な構成要素であり、基質中に含まれる非常に多くの化学・生物物理学的シグナルは細胞を制御することから、幹細胞は微小環境内の化学・物理学的シグナルに非常に敏感であることが見て取れる。この研究グループは、異なる化学基は神経幹細胞の接着、遷移及び分化を制御できることを見出し、神経幹細胞の方向制御機能のある生物材料の研究開発に理論上の参考及び根拠を提供した。われわれは、さまざまな化学的官能基を有する材料表面において脂肪幹細胞の挙動を研究した際に、材料表面の化学基は幹細胞の挙動（接着、増殖、遷移）に対して重要な影響を持つことを見出した。最近、わが研究グループはそれぞれの化学官能基が神経幹細胞に対して顕著な調節作用があるのは、細胞内部のシグナルがたんぱく質の調整作用を受けることと関係し（図3、表1を参照）、メチル基及びアミノ基による神経幹細胞の内部のタンパク質の異なるシグナルに対する影響は明らかに異なることを見出した。

　微小環境の力学的性能も細胞骨格、細胞の接着及び成長に影響し、幹細胞の分化にさえ影響することが一部の研究により明らかになっている。先行研究によれば、幹細胞が感受しうる外部シグナルには可溶性要素、細胞と細胞の接触、基質材料の化学的性質及び力学的性能、外的刺激シグナルがある（図2参照）。このことから、基質材料は幹細胞に対し重要な制御作用があることが分かる。神経幹細胞について言えば、外部シグナルの制御作用への材料の使用に注目する研究がすでに多くなされているとは言え、関連する基礎的な問題は完全には解明されていない。例えば、神経幹細胞に対する材料の化学的シグナル制御に関する挙動の法則や、材料の分解性能が3次元骨格中の神経幹細胞にどのような影響を与えるか、神経幹細胞表面の特異的レセプターに作用する化学的シグナルのタイプ及び成分、ならびにシグナルが細胞内部に伝達するルート、2次元または3次元システム中の神経幹細胞に対する外的機械力(剪断力等を含む)による制御作用等がある。生物材料を用いて神経幹細胞に対する正確な制御及び一定方向の誘導を達成することは、これら基礎的な問題の探求いかんにかかっている。

　最近の新たな考え方には、材料骨格中に神経幹細胞を複合して再生された軸索を成長させ、病巣と機能の回復に関する神経をブリッジして連結させることで脊髄修復を実現する方法がある。最近、われわれは架橋ヒアルロン酸（HA）ハイドロゲルにBDNF及びVEGFのPLGAマイクロスフェアを加えることで中枢神経系における神経幹細胞のシグナル伝達を良好に制御することができた。このほか、ポリ-L-リジン（PLL）及びNogo-66レセプター抗体（antiNgR）（HA-PLL/antiNgR）により改質されたヒアルロン酸（HA）ハイドロゲルを薬物投与後のラットの脊髄に移植した結果、ラットの脊髄細胞は顕著に改善された。再生した神経細胞からはすでに軸索及び髄鞘が伸長している。いずれの研究結果からも、ヒアルロン酸基ハイドロゲルは脳の損傷修復に用いる再生医療用の足場材料として非常に有望であることがわかる。

図2 外部シグナルによる幹細胞制御のモデル図

図3 神経幹細胞の内部のタンパク質の異なるシグナルに対するメチル基及びアミノ基の対比

4 今後の展望

　人工材料を使用して微小環境を精確に制御し、神経幹細胞移植後における再生の空間的・時間的プロセスをコントロールすることによって、細胞治療において神経幹細胞をより効果的に体内に統合することは、非常に重要な試みである。このため、神経幹細胞の状態と運命が材料によっていかに制御されるか、ならびに将来の幹細胞治療における生物材料応用の潜在力を研究することは、現在の神経幹細胞治療及びCNS再生医療研究において非常に重要な要素となっている。

　とは言え、抗原性を持たず、大規模生産が可能で、力学的に制御可能で、鍵となる細胞を制御できるシグナルを持つ材料を設計するには依然として多くの課題が存在する。これら問題が解決されれば、生物活性材料により細胞に適した微小環境を設計することができ、体外で細胞を維持できるだけでなく、体内では中枢神経系の疾病または損傷部位という劣悪な環境下で細胞を保護できることから、中枢神経の損傷及び疾病の治療効果を大いに改善することができるだろう。